研究背景:创面愈合整个过程是一个非常复杂的过程,创面因为局部外伤或者病变使得皮肤完整性遭受破坏而形成的损伤。初期,创面内不同的信号通路就已经激活,便进入创面愈合的生理步骤。一般分为四个不同的时期:出血期,炎症期,增殖期以及重塑期。不同的时期包含各种不同的影响因素。创面愈合开始后,创周成纤维细胞增殖并合成分泌胶原为角质形成细胞移行铺平道路,而角质形成细胞先是通过解离细胞间以及细胞和基质之间的粘附和连接,细胞肌动蛋白微丝重排等来驱使细胞不断地向创面中心移动。而这过程受生长因子,细胞因子,趋化因子,抗菌肽,氧分压以及金属蛋白酶基质等诸多因素的影响。当然创面愈合是个多步骤,由多种细胞共同完成的过程,创面再上皮化(re-epithelialization)作为其中的关键环节,在表皮屏障的完整性恢复中起着至关重要的作用。HIF-1α是一种十分重要的转录因子,一般认为在低氧条件下被调控基因转录,参与细胞的各种代谢及其他生物学功能。HIF-1α参与调控60多种基因,并调控细胞的增殖以及移行,而细胞的增殖移行在创面愈合中也发挥重要作用。HIF-1α表达升高可以明显改善糖尿病的创面愈合。有文献报道抑制HIF-1α表达可以明显使得成纤维细胞移行减慢,而上调HIF-1α表达则可以明显加快成纤维细胞移行。在人的角质形成细胞中,HIF-1α可以提高细胞的移行,但是具体机制仍然不是很清楚。因此,研究HIF-1α对角质形成细胞移行调控十分重要。目前,临床上有很多方法用来治疗创面愈合。包含生长因子的使用,负压吸引,敷料包扎。最近,还出现了一些物理疗法,比如电场,磁场的应用。而进年来光疗在创面上应用也得到了极大普及和发展。而且被证明是十分有效的手段。低能量的激光可以很好的改善创面愈合。这一结论已被很多实验证实,而LED灯光和激光也有着同样的效果。本文主要介绍红光(640nm)对创面角质形成细胞移行的影响。虽然很多报道光照可以促进创面愈合,但是较少报道具体阐述其分子机制,因此,本文阐述了红光对角质形成细胞移行的影响,以及其分子HIF-1α表达变化。光照确实可以改变细胞的骨架形态,在He La细胞和内皮细胞中HIF-1α表达升高后细胞骨架得到改变。所以我们假设在角质形成细胞中,光照是否一样可以通过改变角质形成细胞的骨架形态进而调节细胞的移行。本文通过上调以及降低角质形成细胞HIF-1α的表达观察角质形成细胞骨架的变化,并同时探讨了红光在阻断HIF-1α下对细胞骨架的影响。从而分析红光对角质形成细胞移行的具体分子机制。研究方法:1.利用人术后包皮组织提取分离原代角质形成细胞,应用红光照射后在活细胞工作站动态拍摄技术下观察单个角质形成细胞的运动性,并使用Image J软件进行分析,同时使用人皮肤角质化细胞片层划痕制作体外细胞创面愈合模型。观察划痕后单层细胞创面愈合面积的变化来观察640nm红光对人角质形成细胞迁移的影响。同时应用CCK-8检测红光对细胞增殖的影响。2.同上述方法红光照射后,然后运用WB法检测光照后的人原代角质形成细胞中HIF-1α表达变化。同时应用鬼笔环肽荧光染色观察光照对人角质形成细胞在光照后骨架的改变。用Image J软件分析骨架改变情况。3.培养分离人角质形成细胞后,分别单纯应用DMOG和COCL2处理角质形成细胞以上调其HIF-1α的表达来观察细胞骨架的改变,并用WB方法验证上调后蛋白表达情况。细胞骨架的免疫染色同上述方法。4.YC-1是HIF-1α特异性阻断剂,在同上述光照及分组方法,在光照下应用YC-1阻断HIF-1α的表达来观察人原代角质形成细胞骨架的改变。结果:1.LED光照促进角质形成细胞的运动和移行。体外细胞实验中,LED红光(12 J/cm2 and 24 J/cm2)与对照组相比,单个角质形成细胞在活细胞工作站观察下运动性增加,其中12 J/cm2更为明显,所以在细胞划痕实验中,主要选择的红光能量也是12 J/cm2。在此能量下,角质形成细胞移行也更为显著。应用CCK-8试剂盒检测不同实验组细胞增殖,提示光照组和对照组没有明显差异。2.LED光源增加角质形成细胞HIF-1α的表达并促进细胞骨架重排通过分析红光照射3,6,12小时后HIF-1α的表达情况,可以发现红光照射可以明显上调角质形成细胞HIF-1α蛋白表达,同时红光照射组细胞形态也展开明显,通过鬼笔环肽荧光染色也可以发现F-actin表达非常明显。3.HIF-1α激动剂氯化钴和DMOG可明显促进角质形成细胞F-actin的表达通过WB方法证明分别单独可以促进角质形成细胞HIF-1α蛋白的表达,同时Co Cl2(100μM、200μM)和DMOG(0.5 m M、1 m M)处理的细胞骨架也明显改变,荧光染色的细胞F-actin表达也更为强烈。4.HIF-1α特异性抑制剂YC-1可以通过阻断HIF-1α抑制光照对细胞骨架的调节。YC-1是特异性HIF-1α阻断剂,通过WB方法检测不同实验组(光照与非光照同时添加YC-1 0,20和50μM)证实YC-1可阻断红光上调角质形成细胞HIF-1α蛋白表达的作用。同时,通过荧光染色细胞骨架比较不同实验组发现,YC-1可以通过降低HIF-1α的表达抑制光照对细胞骨架表达的积极作用。结论本章节研究发现LED红光(640nm)明显提高人角质形成细胞的运动性以及细胞移行,但对细胞增殖没有促进作用。LED光能明显上调角质形成细胞HIF-1α的表达,同时促进细胞F-actin的表达,而此与细胞的移行密切相关。单纯的HIF-1α促进剂处理角质形成细胞后也可以促进细胞F-actin的表达,而YC-1可以抑制HIF-1α的表达,同时抑制了红光对细胞骨架表达的积极作用。所以我们可以得出LED红光是通过HIF-1α改变细胞骨架,从而调控角质形成细胞移行,进一步影响再上皮化和创面愈合的过程。