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目的:1.建立生物样品中呋喃丹及代谢物呋喃酚的GC-MS/MS定性定量方法;2.建立保存检材中呋喃丹及其代谢物呋喃酚的分解动力学研究方法;3.为呋喃丹意外死亡和中毒案件法医学鉴定中毒检验结果的分析提供实验依据。方法:1.样品处理与分析血液和肝组织样品中加入内标(TBP),经酸化处理,二氯甲烷萃取。采用GC-MS/MS法定性定量分析样品中呋喃丹及其代谢产物呋喃酚。2.呋喃丹稳定性研究配制0.1μg/m L、0.2μg/m L、8.0μg/m L的呋喃丹标准储备液,贮藏在4℃、﹣20℃冰箱中,分别于0d及10.0d、20.0d、34.0d检测呋喃丹含量。取空白血液1m L和肝脏1g若干份,分别添加呋喃丹标准品,配制成浓度为0.1μg/m L(μg/g)、0.2μg/m L(μg/g)、8.0μg/m L(μg/g)的样品;取空白血液1m L若干份,分别添加抗凝剂枸橼酸钠0.5mg/m L、2.5mg/m L、20.0mg/m L以及添加呋喃丹标准溶液,均配制成含不同浓度抗凝剂的2.0μg/m L呋喃丹溶液的样品。添加呋喃丹和加有枸橼酸的样品经萃取挥干后,分别用封口膜封口,4℃冰箱保存。分别于0d及10.0d、20.0d、34.0d检测呋喃丹含量。3.分解动力学研究本地犬(雄性)6只,4LD50(13.5mg/kg)呋喃丹灌胃。观察动物反应,待呼吸心跳全部消失,分别取血液和肝脏。血液分五等份分别置于20℃(1%Na F)、20℃(NC)、20℃、4℃、-20℃五种条件下保存;肝脏分四等份分别置于20℃(4%FA)、20℃、4℃、-20℃四种条件下保存。于不同时间点检测各保存样品中呋喃丹及其代谢物呋喃酚的含量,3p97拟合分解动力学方程,计算呋喃丹和呋喃酚在不同保存条件下不同样品中的分解半衰期。4.统计学方法SPSS19.0统计软件,对呋喃丹和呋喃酚检材的不同保存条件之间、不同时间之间进行配对t检验,比较不同保存条件和时间对呋喃丹和呋喃酚的分解动力学过程有无影响。结果:1.GC-MS/MS分析CBF、7PH和TBP各峰形均对称,可完全分离。血液和肝组织中CBF、7PH工作曲线线性范围均是:0.01~10.00μg/m L,最低检出限0.06~0.54ng/m L,方法回收率93.4%~112.0%,RSD<6.0%。2.呋喃丹稳定性实验结果(1)标准储备液稳定性:4℃保存0.1μg/m L~8.0μg/m L呋喃丹的标准储备液,在20.0d~34.0d下降至初始浓度的78.6%~88.8%,偏差为11.2%~21.4%,P<0.05,差别有统计学意义;﹣20℃保存0.1μg/m L呋喃丹的标准储备液,34.0d下降至初始浓度的82.5%,偏差为17.5%,P<0.05,差别有统计学意义。(2)提取残渣中的稳定性:4℃保存的已提取的0.1μg/m L~8.0μg/m L血液和肝脏中呋喃丹的含量,7.0d~30.0d下降至初始浓度的59.5%~88.7%,偏差为11.3%~40.4%,P<0.05,差别有统计学意义。(3)样品添加枸橼酸钠对提取残渣稳定性的影响:4℃保存的已提取0.5mg/m L~20.0mg/m L枸橼酸钠添加血液中呋喃丹的含量,7.0d下降至初始浓度的50.3%~62.2%,偏差为37.7%~49.8%,P<0.05,差别有统计学意义。3.呋喃丹及代谢物呋喃酚在保存检材中的分解动力学(1)分解动力学:呋喃丹、呋喃酚在保存检材中的分解动力学符合一级动力学过程,20℃(1%Na F)、20℃(NC)、20℃、4℃、-20℃保存条件下血液中呋喃丹和呋喃酚,分解半衰期分别为2.0d±0.1d、2.4d±0.1d、3.3d±0.1d、5.6d±0.5d、2.0d±1.0d和14.4d±6.3d、15.7d±4.9d、16.3d±11.0d、15.9d±10.0d、23.5d±9.0d。20℃(4%FA)、20℃、4℃、-20℃保存条件下肝脏中呋喃丹和呋喃酚,分解半衰期分别为18.5d±4.4d、2.9d±0.3d、3.3d±1.0d、8.3d±1.0d和19.0d±12.0d、12.3d±9.3d、28.3d±16.8d、24.7d±23.6d。(2)呋喃丹和呋喃酚在不同保存条件下的含量变化:不同条件保存血液和肝脏中呋喃丹的含量均呈下降趋势,前7.0d显著下降(P<0.05),随后变化较稳定。20℃(1%Na F)、20℃(NC)、20℃、4℃、-20℃保存条件下血液中呋喃丹含量在7.0d和83.0d分别下降至初始浓度的10.2%~51.0%和0%~6.9%,检出时限为83.0d~150.0d。20℃(4%FA)、20℃、4℃、-20℃保存条件下肝脏中呋喃丹的含量7.0d和150.0d分别下降至初始浓度的18.7%~58.7%和0%~7.2%,检出时限为83.0d~150.0d。不同条件保存血液和肝脏中呋喃酚的含量均呈先升高后下降趋势,0d即可检测到呋喃酚。20℃(1%Na F)、20℃(NC)、20℃、4℃、-20℃保存条件下血液中呋喃酚含量15.0d显著升高(P<0.05),15.0d升高至初始浓度的195.0%~1339.0%和150.0d下降至初始浓度的0%~97.0%,检出时限为83.0d~150.0d。20℃(4%FA)、20℃、4℃、-20℃保存条件下肝脏中呋喃酚含量7.0d显著升高(P<0.05),7.0d升高至初始浓度的182.8%~539.8%和150.0d下降至初始浓度的0%~30.9%,检出时限为83.0d~150.0d。结论:1.建立了血液和肝脏中测定呋喃丹、呋喃酚的GC-MS/MS分析方法,该方法简便、灵敏、重现性好,适用于呋喃丹意外中毒案件的快速鉴定。2.呋喃丹的标准储备液在﹣20℃和4℃条件下保存均可发生分解,﹣20℃条件下分解速度较4℃慢,高浓度较低浓度分解速度慢,偏差小。提示呋喃丹的标准储备液应在﹣20℃且高浓度条件下保存。标准储备液浓度与新配制的储备液浓度的偏差不应超过5%,提示4℃和﹣20℃保存0.1μg/m L、0.2μg/m L、8.0μg/m L呋喃丹标准储备液的有效期分别在10.0d、10.0d、20.0d内和10.0d、20.0d、34.0d内。呋喃丹在4℃保存的已提取检材(血液和肝脏)中,高浓度较低浓度保存浓度变化小,偏差小。在稳定性考察中,其可接受标准为样品与真实浓度的偏差不超过15%。提示4℃保存的已提取的呋喃丹浓度为0.1μg/m L、0.2μg/m L、8.0μg/m L血液和肝脏中,检材检测有效期分别为7.0d、15.0d、15.0d内和7.0d、7.0d、15.0d内。呋喃丹在枸橼酸钠提取后保存检材中,枸橼酸钠浓度越高,呋喃丹下降速度越快,偏差越大,说明枸橼酸钠可加快呋喃丹的分解。提示4℃保存的枸橼酸钠已提取检材,在保存7.0d后不能代表检材采取当时的浓度,不建议作为样品继续检测。呋喃丹在各保存条件下的有效期,为呋喃丹中毒检测提供了参考。3.呋喃丹及其代谢物呋喃酚在各保存条件下均可发生分解,20℃保存分解较快,-20℃分解速度最慢,血液中呋喃丹和呋喃酚在枸橼酸钠和氟化钠保存条件下分解速度加快。在呋喃丹的意外死亡和中毒的实际案件中,检材应及时送检,低温保存,并同时检测呋喃丹和呋喃酚,不适宜分别用枸橼酸钠和氟化钠作抗凝剂和防腐剂。4.呋喃丹及其代谢物呋喃酚在保存检材中的分解动力学符合一级动力学过程,根据动力学方程计算的理论值与实测值符合情况良好,利用该分解动力学方程,可以推测检材采取当时血液和肝脏中呋喃丹的含量,为呋喃丹意外死亡和中毒案件法医学鉴定中毒检验结果的分析提供了实验依据。