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研究背景与目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。迄今为止,手术、放疗、化疗仍然是乳腺癌的主要治疗手段。其中化疗以其在手术前控制和缩小病灶,手术后防止复发转移等特殊作用而在乳腺癌综合治疗中占有不可替代的地位。但是几乎不可避免的化疗耐药一直是有效控制乳腺癌的瓶颈。乳腺癌耐药与乳腺癌患者复发及侵润转移相关,但发生机制并未明确。因此研究乳腺癌耐药机制,寻找新的耐药标志物对于有效逆转乳腺癌耐药,提高乳腺癌治疗水平具有非常重要的理论意义和潜在的临床应用价值。长非编码RNA (Long no-coding RNA, LncRNA)是一类长度在200bp以上的非编码RNA。许多研究显示LncRNA可能参与到肿瘤发生发展、治疗耐受等多种病理过程。本课题采用LncRNA基因芯片检测了我们前期建立的5-氟尿嘧啶诱导的乳腺癌多药耐药细胞系(MCF7/5FU)和亲本细胞(MCF7) LncRNA表达差异,旨在构建乳腺癌耐药细胞与敏感细胞LncRNA差异表达谱,筛选和鉴定乳腺癌耐药相关LncRNA,为阐述乳腺癌耐药机制提供新的理论依据。实验方法1.通过长非编码RNA高通量基因芯片分析5-氟尿嘧啶诱导的乳腺癌多药耐药细胞(MCF7/5FU)与亲代乳腺癌细胞(MCF7)之间的长非编码RNA表达差异.本项目受国家自然科学基金资助(基金资助号：81272450)2.荧光实时定量PCR从MCF7/5FU及亲代MCF7细胞和12例乳腺癌组织及配对癌旁组织验证H19等片段的表达差异；3.采用靶向H19的siRNA干扰MCF7和T47D细胞中H19的表达,实时定量PCR检测干扰效果,MTS检测H19干扰后细胞耐药性变化；4.构建H19表达慢病毒感染H19低表达的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞,嘌呤霉素筛选后获得H19稳定高表达细胞系,MTS检测其耐药性变化；5. Western blot检测H19干扰和过表达细胞中EMT标志物的表达变化情况；Transwell实验确定这些细胞侵袭性的变化；6.实时定量PCR确定H19干扰的MCF7、T47D细胞、H19过表达的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞相对对照细胞miRNA200c的表达变化,western blot检测miRNA200c的下游分子ZEB1的表达变化；7.将miRNA200c抑制物导入H19过表达细胞,MTS、transwell和western blot检测miRNA200c抑制物对H19表达的影响,确定miRNA200c在H19参与的调控过程中的作用；8.染色质免疫共沉淀(CHIP)检测H19干扰的MCF7、T47D细胞、H19过表达的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞相对对照细胞miRNA200c启动子组蛋白H3乙酰化改变情况,确定H19对miRNA200c的表达调控机制；实验结果1.基因芯片和实时定量PCR提示H19长非编码RNA在药物敏感乳腺癌细胞MCF7和药物耐受乳腺癌细胞MCF7/5FU之间存在明显的表达差异。在MCF7/5FU细胞中H19表达明显下调。另外在先天耐药的乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中同样存在明显的H19表达下调；2.H19的表达水平在乳腺癌组织中相对癌旁正常组织存在显著的表达下调；3.在药物敏感的上皮表型乳腺癌细胞MCF7和T47D中干扰H19表达后这些细胞对5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、紫杉醇等三种化疗药物的敏感性出现了一定程度的下降；4.通过慢病毒表达载体在乳腺癌耐药细胞系MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞中过表达H19,MTS实验检测发现这两株细胞的耐药性出现部分逆转；5.H19干扰的MCF7和T47D细胞EMT标志物表达出现变化,上皮标志物E-cadherin表达下调,间充质标志物Vimentin表达上调,且侵袭性上升；6.干扰H19表达的MCF7和T47D细胞中miR200c表达量下降,过表达H19的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞中miRNA200c表达量上升；且H19过表达的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞的EMT标志物出现变化,上皮标志物E-cadherin表达上调,间充质标志物Vimentin表达下调,且侵袭性下降；7.在H19过表达的MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞中转入miRNA200c抑制物后,这两株细胞的耐药性上升、侵袭性增强且上皮标志物表达下调,间充质标志物上调；8. CHIP实验显示干扰H19后MCF7和T47D细胞miRNA200c启动子区域组蛋白H3乙酰化水平下降,而过表达H19后MCF7/5FU和MDA-MB-231细胞miRNA200c启动子区域组蛋白H3乙酰化水平上升；结论1.H19长非编码RNA为乳腺癌多药耐药的重要标志物,其表达下调是乳腺癌化疗耐受和侵袭性增强的原因之一；2.H19长非编码RNA通过激活miRNA200c对抗乳腺癌细胞上皮-间充质转化(EMT)增加乳腺癌细胞药物敏感性,降低细胞侵润；3.H19长非编码RNA主要通过提高miRNA200c启动子区域组蛋白H3乙酰化水平而激活miRNA200c表达。