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背景：慢性肾病(Chronic Kidney Disease，CKD)及其引起的终末期肾病发病率逐年提高，成为危害公众健康的重大公共卫生问题。CKD预后差、花费高，目前现代医学尚无逆转或阻断CKD进展的特效药物和满意方法。因此，给人们日常生活和生命健康带来巨大的影响。阿霉素肾损伤（Adriamycin Nephropathy，AN）动物模型是一种研究慢性肾病病理机制和开发治疗药物的典型模型，常以高蛋白尿、低蛋白血症、高血脂及水肿为特征，其病理过程表现为足细胞的损伤、肾小管间质炎症和纤维化，继之肾小球硬化和肾功能衰竭。氧化应激在肾脏足细胞损伤和肾小球硬化中是尤为重要的，早期的研究发现氧化应激是促进足细胞损伤和蛋白尿产生的一个重要原因。炎症反应是导致AN进展至终末期肾病的关键要素，ADR经血液循环方式可以到达肾脏并直接破坏肾脏固有细胞，诱导炎症反应的产生。
FGF1（Fibroblast GrowthFactor1）是一种来源于神经外胚层和中胚层的细胞生长因子，对多种细胞具有生物学活性，其具有显著的促细胞分裂能力。已有研究报道FGF1可以降低2型糖尿病小鼠血糖、促进其脂肪组织重构以及提高胰岛素敏感性，FGF1跟代谢调控之间的联系逐渐受到人们的关注和重视，同时也发现FGF1对糖尿病肾病有保护作用，但是其促分裂活性可能带来增殖风险，因此，构建了促分裂能力较低的突变体FGF1ΔHBS。FGF1ΔHBS是通过减少FGF与受体二聚体的水平从而减弱FGF1的有丝分裂活性，但是仍然保留调节代谢的功能，这为FGF1ΔHBS成为一种治疗慢性肾病药物提供一种可能。
目的：本研究旨在探究FGF1ΔHBS对阿霉素肾损伤的治疗作用，并通过体内体外实验证实FGF1ΔHBS的肾脏保护作用是通过干预氧化应激和炎症反应实现的，并进一步证实其抗氧化作用是通过AKT/GSK-3β信号通路，抗炎作用则通过AKT与ASK1信号通路。通过此项研究，将更进一步了解FGF1ΔHBS在阿霉素肾脏疾病中发挥的作用，同时为慢性肾病的临床治疗提供新的想法和方式。
方法：非促分裂型FGF1蛋白构建、表达和纯化：用点突变试剂盒对FGF1肝素结合位点进行突变（Lys127Asp，Lys128Gln和Lys133Val），取得了无促分裂活性的全新FGF1突变体FGF1ΔHBS的编码序列。之后将FGF1ΔHBS片段与pET-20b质粒重组连接，转化、鉴定、测序。将测序无误的pET-20b-FGF1ΔHBS转染到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37℃摇床摇至A600=0.8时，加入1mM异丙基-L-硫代-β-吡喃葡萄糖苷（IPTG）继续摇床中诱导4h后，使用匀浆机把细胞破碎。用离子交换色谱（Source Q）和分子筛（S-100）纯化FGF1ΔHBS蛋白，获得高纯度的目的蛋白，蛋白纯度使用SDS-PAGE电泳进行检测，纯度＞98%时用于后续实验。
FGF1ΔHBS对阿霉素肾脏作用的体内研究：（1）阿霉素肾损伤模型：选取8周龄合适体重的雄性BALB/c小鼠24只，随机分为正常对照组，模型组和给药组（8只/组），给药组提前一周腹腔注射FGF1ΔHBS（0.5mg/kg）剂量隔天给药，然后，模型组和给药组使用尾静脉注射法，注射ADR（10.5mg/kg）进行造模，造模后，分别采用隔天腹腔注射（IP）0.9%生理盐水和FGF1ΔHBS（0.5mg/kg）的方式，连续注射4周，正常对照组和模型组小鼠则同时注射0.9%生理盐水，处死前一天收取12h尿液。（2）收取小鼠血清和肾脏，通过自动生化分析仪检测小鼠尿素氮，血清肌酐以及尿蛋白，采用实时荧光定量PCR，Western Blot，透射电镜，免疫组化，免疫荧光和多种染色方法检测肾脏病理学、氧化应激和炎症反应的变化，以及AKT与GSK-3β/ASK1信号通路激活的变化。
体外细胞实验研究FGF1ΔHBS对阿霉素肾损伤的影响：使用Gibco1640培养基（含有FBS10%，链霉素100U/mL，青霉素100U/mL）培养MPC（小鼠足细胞），部分细胞使用siRNA敲除AKT表达或者AKT的抑制剂MK-2206抑制AKT磷酸化，等到细胞生长至亚汇合时，使用不含血清但含有抗生素的饥饿培养基处理12h，之后用FGF1ΔHBS(100ng/mL)处理12h，同时用0.5μg/mL阿霉素刺激，收集细胞进行WB和q-PCR，检测细胞氧化应激和炎症指标的变化以及A KT与GSK3-β/ASK1信号通路激活。
结果：阿霉素肾损伤模型组的小鼠尿液及血液分析结果表明肾功能指标血清肌酐、尿素氮及尿蛋白含量增加，而注射FGF1ΔHBS治疗后，各项指标都有显著下降，这些结果表明了FGF1ΔHBS具有肾脏保护作用。HE、Masson以及PAS的染色结果表明阿霉素可以导致小鼠出现明显的肾小球肥大，系膜基质扩张以及肾纤维化，在注射FGF1ΔHBS治疗后，这些症状都有了明显缓解；Western Blot、组织免疫组化、免疫荧光以及q-PCR结果表明，FGF1ΔHBS显著改善了肾脏的病变，且增加了肾脏抗氧化和抗炎能力。细胞实验结果则说明，FGF1ΔHBS通过AKT靶点可以调控阿霉素诱导的细胞活性氧表达，提高了GSK-3β磷酸化水平和抗氧化能力。同时FGF1ΔHBS通过ASK1调控炎症反应，显著抑制炎症相关的促炎信号（包括TNF-α和IL-1β），这些结果都与体内实验一致。
结论：腹腔给予FGF1ΔHBS显著改善了阿霉素肾损伤模型小鼠肾小球的受损程度，同时也缓解了肾功能障碍。同时，在体内和体外的研究发现，FGF1ΔHBS抑制肾炎症和氧化应激通过AKT介导GSK-3β和ASK1信号减弱而发挥作用。结果表明，FGF1ΔHBS通过阻断损伤肾组织中氧化信号级联以及炎症反应而改善阿霉素肾损伤。
FGF1（Fibroblast GrowthFactor1）是一种来源于神经外胚层和中胚层的细胞生长因子，对多种细胞具有生物学活性，其具有显著的促细胞分裂能力。已有研究报道FGF1可以降低2型糖尿病小鼠血糖、促进其脂肪组织重构以及提高胰岛素敏感性，FGF1跟代谢调控之间的联系逐渐受到人们的关注和重视，同时也发现FGF1对糖尿病肾病有保护作用，但是其促分裂活性可能带来增殖风险，因此，构建了促分裂能力较低的突变体FGF1ΔHBS。FGF1ΔHBS是通过减少FGF与受体二聚体的水平从而减弱FGF1的有丝分裂活性，但是仍然保留调节代谢的功能，这为FGF1ΔHBS成为一种治疗慢性肾病药物提供一种可能。
目的：本研究旨在探究FGF1ΔHBS对阿霉素肾损伤的治疗作用，并通过体内体外实验证实FGF1ΔHBS的肾脏保护作用是通过干预氧化应激和炎症反应实现的，并进一步证实其抗氧化作用是通过AKT/GSK-3β信号通路，抗炎作用则通过AKT与ASK1信号通路。通过此项研究，将更进一步了解FGF1ΔHBS在阿霉素肾脏疾病中发挥的作用，同时为慢性肾病的临床治疗提供新的想法和方式。
方法：非促分裂型FGF1蛋白构建、表达和纯化：用点突变试剂盒对FGF1肝素结合位点进行突变（Lys127Asp，Lys128Gln和Lys133Val），取得了无促分裂活性的全新FGF1突变体FGF1ΔHBS的编码序列。之后将FGF1ΔHBS片段与pET-20b质粒重组连接，转化、鉴定、测序。将测序无误的pET-20b-FGF1ΔHBS转染到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，37℃摇床摇至A600=0.8时，加入1mM异丙基-L-硫代-β-吡喃葡萄糖苷（IPTG）继续摇床中诱导4h后，使用匀浆机把细胞破碎。用离子交换色谱（Source Q）和分子筛（S-100）纯化FGF1ΔHBS蛋白，获得高纯度的目的蛋白，蛋白纯度使用SDS-PAGE电泳进行检测，纯度＞98%时用于后续实验。
FGF1ΔHBS对阿霉素肾脏作用的体内研究：（1）阿霉素肾损伤模型：选取8周龄合适体重的雄性BALB/c小鼠24只，随机分为正常对照组，模型组和给药组（8只/组），给药组提前一周腹腔注射FGF1ΔHBS（0.5mg/kg）剂量隔天给药，然后，模型组和给药组使用尾静脉注射法，注射ADR（10.5mg/kg）进行造模，造模后，分别采用隔天腹腔注射（IP）0.9%生理盐水和FGF1ΔHBS（0.5mg/kg）的方式，连续注射4周，正常对照组和模型组小鼠则同时注射0.9%生理盐水，处死前一天收取12h尿液。（2）收取小鼠血清和肾脏，通过自动生化分析仪检测小鼠尿素氮，血清肌酐以及尿蛋白，采用实时荧光定量PCR，Western Blot，透射电镜，免疫组化，免疫荧光和多种染色方法检测肾脏病理学、氧化应激和炎症反应的变化，以及AKT与GSK-3β/ASK1信号通路激活的变化。
体外细胞实验研究FGF1ΔHBS对阿霉素肾损伤的影响：使用Gibco1640培养基（含有FBS10%，链霉素100U/mL，青霉素100U/mL）培养MPC（小鼠足细胞），部分细胞使用siRNA敲除AKT表达或者AKT的抑制剂MK-2206抑制AKT磷酸化，等到细胞生长至亚汇合时，使用不含血清但含有抗生素的饥饿培养基处理12h，之后用FGF1ΔHBS(100ng/mL)处理12h，同时用0.5μg/mL阿霉素刺激，收集细胞进行WB和q-PCR，检测细胞氧化应激和炎症指标的变化以及A KT与GSK3-β/ASK1信号通路激活。
结果：阿霉素肾损伤模型组的小鼠尿液及血液分析结果表明肾功能指标血清肌酐、尿素氮及尿蛋白含量增加，而注射FGF1ΔHBS治疗后，各项指标都有显著下降，这些结果表明了FGF1ΔHBS具有肾脏保护作用。HE、Masson以及PAS的染色结果表明阿霉素可以导致小鼠出现明显的肾小球肥大，系膜基质扩张以及肾纤维化，在注射FGF1ΔHBS治疗后，这些症状都有了明显缓解；Western Blot、组织免疫组化、免疫荧光以及q-PCR结果表明，FGF1ΔHBS显著改善了肾脏的病变，且增加了肾脏抗氧化和抗炎能力。细胞实验结果则说明，FGF1ΔHBS通过AKT靶点可以调控阿霉素诱导的细胞活性氧表达，提高了GSK-3β磷酸化水平和抗氧化能力。同时FGF1ΔHBS通过ASK1调控炎症反应，显著抑制炎症相关的促炎信号（包括TNF-α和IL-1β），这些结果都与体内实验一致。
结论：腹腔给予FGF1ΔHBS显著改善了阿霉素肾损伤模型小鼠肾小球的受损程度，同时也缓解了肾功能障碍。同时，在体内和体外的研究发现，FGF1ΔHBS抑制肾炎症和氧化应激通过AKT介导GSK-3β和ASK1信号减弱而发挥作用。结果表明，FGF1ΔHBS通过阻断损伤肾组织中氧化信号级联以及炎症反应而改善阿霉素肾损伤。