研究背景我国冠心病发病率正逐年攀升并呈年轻化趋势,而急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)是冠心病最为凶险的一种类型,我国每年约百余万患者死于AMI。因此,该病被视为“人类健康第一杀手”。随着冠脉搭桥术、经皮冠脉腔内成形术等血管再通术日臻成熟,AMI的再灌注治疗被广泛开展。及时恢复冠脉血流是挽救急性缺血心肌的根本措施,但心肌在恢复血流的同时也会导致再灌注损伤,即所谓的心肌缺血-再灌注(Ischemia-Reperfusion, I-R)损伤,如何有效减轻这种损伤,使再灌注治疗最大获益成为AMI治疗的最大挑战。黄芩苷(baicalin)是从广泛使用的中药黄芩(Scutellaria baicalensis Georigi)的干燥根中提取的一种黄酮类化合物,黄芩苷是黄芩的主要生物活性成分之一,具有多重药理作用,如抗菌、镇静、减轻炎症反应及较强的抗氧化等特性。因而,近年来被广泛研究。黄芩苷多种病理生理条件下被广泛研究,最近有研究报道黄芩苷预处理能有效减轻肝脏及脑组织的I-R损伤。在一些体外研究中,黄芩苷及其苷元黄芩素被报道具有保护心肌损伤的作用。最近,一项体外研究报道：黄芩苷预处理可通过抗炎机制缓解培养的新生大鼠心肌细胞凋亡。Tu IH等也报道黄芩苷能减少缺氧-复氧诱导的心肌细胞凋亡。然而,黄芩苷在缺血性心脏疾病中的在体研究较少。Peng及其同事近期研究证实：口服黄芩苷预处理能通过抗氧化机制有效保护心肌缺血性损伤。然而,黄芩苷对心肌缺血再灌注损伤的体内研究及相关机制未见报道。研究证实氧自由基过度形成及钙超载是导致心肌I-R损伤的主要因素。持续的心肌缺血及缺血后心肌再灌注均可导致心肌细胞凋亡,尽管再灌注可减少凋亡心肌细胞数,但却使不可逆转的心肌细胞加速凋亡。这是由于再灌注早期ROS爆发,在这种氧化应激条件下,线粒体通透性转换孔大量开放,线粒体功能障碍可导致细胞凋亡。我们提出假说：黄芩苷预处理通过抑制线粒体损伤介导的凋亡保护心肌缺血再灌注损伤。目的1.建立小鼠心肌缺血再灌注损伤模型,在动物体内水平证实黄芩苷预处理对心肌缺血再灌注损伤的作用；2.探索黄芩苷能否通过减轻线粒体损伤介导的凋亡保护心肌缺血再灌注损伤。对象和方法第一部体内实验本实验选用野生型小鼠(8至10周龄,体重25至28g的雄性C57BL/6小鼠),结扎冠状动脉左前降支45分钟后解除结扎线2小时,构建小鼠心肌缺血再灌注损伤模型。预实验中,实验对象被分成5组：假手术组、Vehicle(生理盐水)+缺血再灌注(I/R)组；黄芩苷(50mg/kg)+I/R组；黄芩苷(100mg/kg)+I/R组；黄芩苷(200mg/kg)+I/R组,实验设计、分组情况及相应结果见“本研究预实验数据与结果”部分。确定最佳药物剂量(100mg/kg)后,小鼠被随机分成3组：假手术组、Vehicle(生理盐水)+缺血再灌注(I/R)组；黄芩苷(100mg/kg)+I/R组。黄芩苷或生理盐水于冠状动脉左前降支结扎前10分钟经静脉输注。(备注：心肌梗死指标中每组n=8；左室功能测定每组n=7；检测凋亡及免疫组化分析时每组n=6；线粒体损伤分析每组n=4；抗氧化检测每组n=5；蛋白免疫分析每组n=3)。第二部体外实验建立心肌细胞缺氧／复氧模型,模拟心肌缺血再灌注过程。乳鼠原代心肌细胞分离和培养：采用胰酶／胶原酶消化法。分为对照组(常氧组),vehicle+缺氧／复氧组和Baicalin+缺氧/复氧组,每组设3个复孔,实验重复3次。观察心肌细胞搏动和形态学变化,CCK8法检测心肌细胞活力；TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平；试剂盒检测LDH及SOD表达水平。所有统计学处理均采用SPSS13.0专业软件进行统计学分析,所有数值均被表达为均数±标准差(x±s)。对各组数据进行方差齐性检验,若方差齐,则组间比较用方差分析,两两比较用最小显著差异法(least significant difference, LSD)方法；当方差不齐时,组间比较采用Welch法进行近似方差分析,两两比较用Dunnett’s T3。P<0.05被认为数据差异具有统计学意义。结果1.动物实验结果(1)黄芩苷预处理减少再灌注后心肌梗死面积。AAR/LVd在各组间经Levene方差齐性检验,发现方差不齐(P=0.001),采用Welch法进行近似方差分析。AAR/LV比值在vehicle组和黄芩苷组(100mg/kg)几乎相等,表明心肌缺血范围在这两组间相似(P=0.425)。INF/AAR经Levene方差齐性检验,方差不齐(P=0.006),采用Welch法进行近似方差分析。黄芩苷预处理组INF/AAR (INF: infarct size)和INF/LV显著降低(F=203.818, P<0.001vs. vehicle组)。vehicle组和黄芩苷预处理组,INF/AAR的平均比率分别为47.750±5.481%及21.088±5.874%。(2)黄芩苷预处理改善心肌I-R后左室功能。左室舒张末内径LVEDD在各组间经Levene方差齐性检验,发现方差齐(P=0.667);LVESD方差不齐(P=0.044)LVFS方差不齐(P=0.001)。左室舒张末内径LVEDD在各组间差异无统计学意义(F=0.129,P=0.880)。左室收缩末内径(LVESD)、LVFS各组间差异有统计学意义(Welch=315.394, P<0.001; Welch=2042.669, P<0.001)。黄芩苷预处理后LVESD同vehicle组相比差异有统计学意义(P<0.001)。黄芩苷预处理同vehicle组相比左室短轴缩短率(LVFS)差异有统计学意义(P<0.001)。(3)黄芩苷预处理抑制I-R诱导的心肌细胞凋亡。TUNEL经Levene方差齐性检验,方差不齐(P<0.001),采用Welch法进行近似方差分析。黄芩苷预处理同vehicle组相比心脏组织中TUNEL阳性细胞核数量差异有统计学意义(P<0.001,每组4只小鼠,每只小鼠心脏分别计数10个视野,n=40)；免疫组化分析显示黄芩苷组cleaved caspase-3表达较vehicle组减少(n=3每组)；Western blot分析Levene方差齐性检验,方差齐(P=0.094),采用LSD进行组间多重比较。Western blot分析显示黄芩苷预处理同Vehicle组相比,caspase-3活性降低,差异具有统计学意义(P<0.011,n=3每组)。(4)黄芩苷预处理对心肌I-R过程中线粒体形态的作用。缺血区线粒体明显肿胀,表现为面积增大,部分线粒体脊消失,而非缺血区域线粒体结构致密；正常线粒体可见电子致密的基质和未破坏的线粒体脊,心肌I-R损伤后,损伤的线粒体可见部分线粒体脊断裂,线粒体基质肿胀,黄芩苷预处理能改善线粒体超微结构损伤。(5)黄芩苷预处理减轻心肌I-R后线粒体肿胀和线粒体分裂。平均线粒体面积经Levene方差齐性检验,方差齐(P=0.378),采用LSD进行组间多重比较。黄芩苷预处理减轻心肌I-R后平均线粒体面积(P<0.01vs. vehicle组,每组4只,每只观察10个视野,n=40)；线粒体分裂百分比经Levene方差齐性检验,方差不齐(P<0.018),采用Welch法进行近似方差分析。黄芩苷预处理减少线粒体分裂百分比(P<0.001vs. vehicle组,每组4只,每只观察5个视野,n=20)。(6)黄芩苷预处理减少心肌I-R后线粒体基质微粒和线粒体周脂滴数。线粒体基质微粒数经Levene方差齐性检验,方差不齐(P<0.001),采用Welch法进行近似方差分析。黄芩苷预处理减少心肌I-R后线粒体基质微粒数(P<0.001vs.vehicle组,n=40每组)；线粒体周脂滴数经Levene方差齐性检验,方差不齐(P=0.042),采用Welch法进行近似方差分析。黄芩苷预处理减少线粒体周脂滴数(P<0.001vs. vehicle组,n=20每组)。(7)黄芩苷预处理在心肌I-R过程中发挥抗氧化作用。Mn-SOD活性经Levene方差齐性检验,方差齐(P=0.432),采用LSD进行组间多重比较。黄芩苷预处理增强心肌中Mn-SOD活性(P<0.001vs. vehicle组)；CAT活性经Levene方差齐性检验,方差齐(P=0.894),采用LSD进行组间多重比较。黄芩苷预处理增加心肌中CAT活性(P=0.018vs. vehicle组);经Levene方差齐性检验,方差不齐(P=0.002),采用Welch法进行近似方差分析。黄芩苷预处理降低ROS活性(P=0.003vs. vehicle组,n=5每组)。(8)黄芩苷预处理通过靶向PKC beta2保护心肌I-R损伤。免疫组化染色显示黄芩苷预处理组心肌中PKC beta2表达下调(n=6心脏/组)；经Levene方差齐性检验,方差不齐(P=0.022),采用Welch法进行近似方差分析。Western blot分析显示黄芩苷预处理组PKC beta2表达水平降低,同vehicle组相比差异有统计学意义(P=0.044,n=3每组)；本研究预实验数据与结果：(1)黄芩苷预处理减少心肌梗死面积：vehicle或黄芩苷处理的心脏的AAR/LV比值相当；INF/AAR经Levene方差齐性检验,方差不齐(P=0.019),采用Welch法进行近似方差分析。不同剂量的黄芩苷均可减少心肌I-R后心梗面积(50、100或200mg/kg),黄芩苷(100mg/kg)(26.483±3.224)较50mg/kg(39.083±3.596)具有更强的限制梗死面积的作用(P=0.001),而200mg/kg的剂量同100mg/kg剂量相比无显著统计学差异(P=1.000,n=6每组)。(2)黄芩苷预处理减少心肌I-R损伤后细胞凋亡及LDH水平。TUNEL阳性细胞比率经Levene方差齐性检验,方差齐(P<0.001),采用LSD进行组间多重比较。不同剂量黄芩苷预处理均可降低TUNEL阳性细胞比率,差异有统计学意义(P<0.001,n=30每组)；LDH水平经Levene方差齐性检验,方差齐(P=0.813),采用LSD进行组间多重比较。黄芩苷预处理降低再灌注2h后血浆LDH水平,(P<0.001,n=8每组)。(3)黄芩苷预处理增加再灌注2h后Bcl-2/Bax比值。Bax免疫组化染色结果,黄芩苷组较vehicle组Bax表达降低；Bax及Bcl-2蛋白表达Western blot分析结果经Levene方差齐性检验,方差齐(Bax:P=0.192; Bcl-2:P=0.197),采用LSD进行组间多重比较。黄芩苷预处理降低Bax蛋白表达,同Vehicle组比较差异有统计学意义(P<0.001); Bcl-2免疫组化染色结果,黄芩苷组较vehicle组Bcl-2表达增加,同Vehicle组比较差异有统计学意义(P<0.001); Western blot分析显示黄芩苷预处理显著增加Bcl-2蛋白表达；Bcl-2/Bax比值经Levene方差齐性检验,方差齐(P=0.202),采用LSD进行组间多重比较。黄芩苷预处理增加心肌再灌注2h后Bcl-2/Bax比值(P<0.001vs. vehicle组,n=3每组)。(4)黄芩苷预处理抑制心肌重构。纤维化面积经Levene方差齐性检验,方差不齐(P=0.018),采用Welch法进行近似方差分析。黄芩苷预处理显著降低心脏纤维化面积(P<0.001vs. vehicle组,n=7每组)；心重/体重比经Levene方差齐性检验,方差齐(P=0.070),采用LSD进行组间多重比较。黄芩苷预处理减少心重/体重比(heart/body weight ratio)(P<0.001vs. vehicle组,n=6每组)；横截面积经Levene方差齐性检验,方差不齐(P<0.001),采用Welch法进行近似方差分析。黄芩苷预处理降低心肌细胞横截面积(P<0.001vs. vehicle组,n=20每组)。2.细胞实验结果(1)胰酶/胶原酶连续消化法成功获取SD乳鼠原代心肌细胞：胰酶/胶原酶连续多次消化获得的细胞悬液接种后12h,细胞形态变为梭形或不规则扁平状,24h后即可看到单个细胞的自发收缩,继而细胞逐渐铺展伸出伪足,形成不规则的星形,到第4-5天,细胞相互接触交织成网,形成细胞簇贴壁,按照相同的频率收缩。(2)心肌细胞缺氧/复氧模型的评估本部分实验重复5次(n=5),采用One-Way ANOVA进行统计分析。细胞凋亡率经Levene方差齐性检验,方差齐(P=0.054),采用LSD进行组间多重比较。结果发现,对照组细胞凋亡率为0.046±0.011,缺氧组细胞凋亡率为0.468±0.039,缺氧/复氧组细胞凋亡率为0.722±0.065。缺氧时心肌细胞凋亡率较正常组增加(P<0.001),恢复氧气供应后,细胞凋亡率不降反升(P<0.001),说明心肌细胞缺氧/复氧模型成功。此外,我们评估了黄芩苷预处理对心肌细胞缺氧／复氧后心肌细胞凋亡率的影响,结果显示黄芩苷预处理组细胞凋亡率为0.616±0.036,较缺氧/复氧组降低(P=0.001)。(3)黄芩苷预处理对心肌细胞缺氧/复氧后细胞活性的影响本部分实验重复5次(n=5),经Levene方差齐性检验,方差不齐(P=0.029),采用Welch法进行近似方差分析。心肌细胞缺氧后活性显著降低,为41.840±1.412(P<0.001vs. Control组),而复氧后心肌细胞活性增加,为64.760±3.371(P<0.001vs. Hypoxia组),我们进一步检测了黄芩苷预处理对心肌细胞活性的影响,结果显示黄芩苷组细胞活性为70.660±3.746,因此,黄芩苷可增加心肌细胞活性(P<0.001vs. H/R组)。(4)黄芩苷预处理对心肌细胞缺氧/复氧时SOD水平的作用本部分实验重复5次(n=5),经Levene方差齐性检验,方差齐(P=0.137),采用LSD进行组间多重比较。心肌细胞缺氧/复氧后SOD水平显著降低,为105.100±5.001(P<0.001vs. Control组),我们进一步检测了黄芩苷预处理对SOD活性的影响,结果显示黄芩苷组SOD活性为122.600±6.006,因此,黄芩苷可增加心肌细胞缺氧/复氧后SOD活性(P<0.001vs. H/R组)。(5)黄芩苷预处理对心肌细胞缺氧/复氧时LDH水平的作用本部分实验重复5次(n=5),经Levene方差齐性检验,方差齐(P=0.267),采用LSD进行组间多重比较。心肌细胞缺氧/复氧后LDH水平升高,为26.800±0.809(P<0.001vs. Control组),我们进一步检测了黄芩苷预处理对LDH活性的影响,结果显示黄芩苷组LDH活性为22.200±1.666,因此,黄芩苷可降低心肌细胞缺氧/复氧后LDH水平,同H/R组相比差异有统计学意义(P<0.001)。结论这些结果证实：黄芩苷预处理能够通过抑制线粒体损伤介导的凋亡保护心肌缺血再灌注损伤。因此,黄芩苷可能是一种很有前景的缓解接受再灌注治疗患者心肌缺血再灌注损伤的药物。