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(一)裸质粒作为基因表达及基因治疗载体,与病毒载体相比有许多突出的优点,但如何提高和延长裸DNA注射介导外源基因转移效率和表达成为该研究领域目前的主要任务。我们首先系统的研究了氯喹对裸质粒介导的人凝血Ⅸ因子在小鼠体内表达的影响。通过尾静脉液压法介导裸质粒转移体系,将含有10 (g pCMV- hFⅨ质粒和不同浓度氯喹(100 μmol/L, 200 μmol/L, 500 μmol/L)的Ringer’s 液 2.2 mL,6-7秒内注射到小鼠体内。在不同的时间,检测小鼠血清中hFⅨ的表达水平及对肝脏的损害。200 μmol/L 氯喹处理组小鼠血清中hFⅨ表达水平最高,注射后8小时表达量为4.4±1.8 μg/mL , 24小时达到9.7±1.6 μg/mL是对照组的3-4倍。3天后各处理组的hFⅨ表达水平没有显著性差异。 病理切片和转氨酶水平检测都表明氯喹对小鼠肝脏没有明显毒副作用。实验结果表明一定浓度的氯喹能安全,有效的提高hFⅨ在小鼠体内的表达。另外我们还探索了去除细菌骨架序列的编码人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)的线状片段DNA(LF DNA)、不同启动子、ITR及单双链对hFⅨ在小鼠中表达的影响。与C DNA 和L DNA 相比,LF DNA 处理组hFⅨ表达水平 1天时达到最高9809 ng/mL,分别是C DNA 和L DNA 处理组的1.5-4倍(P<0.05)。 30天时下降到246 ng/mL, 到论文截稿时止(256天)一直维持在300ng/mL左右。 血清中TNF-α 和 IL-12水平比C DNA 和L DNA 处理组下降了4倍。结果表明去除细菌骨架序列的LF DNA更能提高和延长了hFⅨ基因在小鼠体内的表达,其原因可能与炎症反应的降低有关。不同启动子、ITR及单双链对外源基因表达没有很明显的影响。LF DNA为我们获得外源基因的长期表达提供了一种好的方法和治疗策略。<WP=6>(二)Tat蛋白和RGD-4C分别与M13噬菌体的pⅧ和pⅢ 融合表达,并在噬菌体基因组中插入由CMV启动子调控的绿色荧光蛋白基因GFP的真核表达框架。用这两种重组M13噬菌体转染细胞,观察GFP表达情况,进而评估Tat蛋白和RGD-4C重组噬菌体作为运载外源基因载体的可行性及存在的问题,为噬菌体应用于基因治疗奠定基础。结果表明重组的Tat-噬菌体能有效的转入哺乳动物细胞:BHK,HeLa,CHO,293,Cos-1等细胞系中,报告基因GFP也获得了表达。经流式细胞仪检测在Cos-1细胞系中有1.08%GFP表达,野生噬菌体转染的细胞中并为发现GFP表达。另外我们证明了噬菌体载体中存在严重的外源基因的丢失,在固体培养(质粒转化)时外源基因的丢失率为10-20%,一次小规模液体培养丢失率为30-50%。初步建立了噬菌体介导的基因转移系统,并对噬菌体载体的优缺点进行了初步的研究,为噬菌体应用于基因治疗奠定基础。