研究背景和目的肿瘤的发生发展是一个多因素作用、多基因参与、经历多个阶段的复杂生物学过程,有许多信号分子参与其中。这些信号分子对肿瘤的作用、作用机制以及信号分子之间的相互关系都很复杂,尚未阐明。S100蛋白家族是一类具有EF-手形结构的钙结合蛋白信号分子,至少有25个成员。其多个成员在肿瘤中表达异常,并参与调节肿瘤细胞的增殖、凋亡和迁移。S100A6是该家族的一员,其基因定位于人染色体lq21,该区的稳定性较差,易发生多种染色体重排和基因扩增,与肿瘤的发生发展相关。在骨肉瘤病人的该染色体位点往往存在异常;同时,已有报道该蛋白在骨肉瘤中表达增高,并且可能参与调节骨肉瘤细胞的迁移等。提示S100A6可能参与骨肉瘤发生发展的过程,但其具体作用及机制尚待研究。本课题拟探讨S100A6对人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS的增殖、凋亡和迁移的作用及可能机制。Wnt/β-catenin信号途径是公认的与肿瘤发生发展密切相关的信号途径,β-catenin是其关键的信号分子。胞浆中β-catenin增多后,可转移到胞核,进而与其相应的转录因子结合,导致该信号途径下游靶基因的转录激活;这些靶基因(如c-myc、细胞周期素D1等)具有促进细胞增殖和迁移等作用。β-catenin的高表达和该信号途径的失调常见于大多数肿瘤,包括骨肉瘤。基于S100A6的高表达与β-catenin的高表达常常同时存在于骨肉瘤以及本课题组前期的研究发现——S100A6与Wnt/β-catenin信号通路中的多个效应分子(包括β-catenin)之间在体外存在特异性直接相互作用,我们假设S100A6对骨肉瘤的作用可能涉及Wnt/β-catenin信号途径。因此,本课题拟探讨S100A6对信号分子β-catenin表达的影响及β-catenin与S100A6对骨肉瘤细胞的作用之间的关系。我们通过重组hS100A6蛋白直接作用的方式和/或用重组腺病毒感染的方式分别转入hS100A6基因及其SiRNA基因、β-catenin基因及其SiRNA基因,探讨hS100A6对人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS细胞的增殖、迁移和凋亡的作用及对β-catenin的影响;在此基础之上,通过分别上调和下调β-catenin的表达,探讨信号分子β-catenin与S100A6对人骨肉瘤细胞的作用之间的关系,为阐明S100A6对骨肉瘤细胞的作用及信号分子β-catenin在该作用中的意义积累更多的实验依据,为发现骨肉瘤诊断和预后判断的分子标志物以及治疗的新靶点提供线索。方法1.重组蛋白GST-hS100A6的制备及相关腺病毒的扩增:将质粒pGST-Moluc-hS100A6和pGST-Moluc转化大肠杆菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST-hS100A6和GST蛋白表达,谷胱甘肽-琼脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads)分离纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳( sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot鉴定这两种重组蛋白,BCA法定量,分装后-80℃保存备用。2.利用HEK293细胞扩增携带hS100A6和β-catenin基因的重组腺病毒(AdS100A6和Adβ-catenin)、携带它们特异的SiRNA基因的的重组腺病毒(AdSiS100A6和AdSiβ-catenin)和对照腺病毒(AdGFP和AdRFP)。3.蛋白终浓度为100μg/ml的重组hS100A6(GST-hS100A6)作用人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS后,分别用MTT法和台盼兰染色/活细胞计数法检测细胞的增殖;Hoechst染色检测细胞凋亡;划痕愈合实验(wound healing assay)和Transwell小室检测细胞的迁移能力。4.通过重组腺病毒分别上调和下调人骨肉瘤细胞S100A6的表达后,用RT-PCR方法检测细胞中β-catenin mRNA的表达;Western blot和免疫细胞化学检测β-catenin蛋白的表达。5.通过重组腺病毒分别上调和下调β-catenin的表达后,用MTT法检测GST-hS100A6对人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS增殖的影响,用Hoechst染色检测GST-hS100A6对细胞凋亡作用的影响,用划痕愈合实验和Transwell小室检测GST-hS100A6对细胞迁移能力的影响。结果1. SDS-PAGE和Western blot鉴定发现,诱导表达、分离纯化后的重组蛋白GST-hS100A6纯度达92﹪;其与抗S100A6抗体在相应的位置出现了阳性反应条带。表明该质粒能诱导表达重组蛋白GST-hS100A6;BCA法蛋白定量,计算出1 L菌液共收获GST-hS100A6蛋白约5.67 mg。2.重组腺病毒感染的HEK293细胞中有相应的绿色或红色荧光蛋白表达,在72 h时感染率约为90%;计算扩增所获病毒液的滴度为:108-109 pfu/ml。3. SDS-PAGE/ Western blot法证实:分别感染AdS100A6及Adβ-catenin后的骨肉瘤细胞MG63中,S100A6和β-catenin的表达量分别增高100%和85%;而感染AdSiS100A6及AdSiβ-catenin后的细胞,S100A6和β-catenin表达则分别减少31.34%和63%。提示:各重组腺病毒均能将其携带的基因导入目的细胞,并正常表达,即各种重组腺病毒的干预有效。4.外源性hS100A6能抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移,并促进凋亡。(1)MTT结果示:GST-hS100A6作用细胞48、72和96 h时,实验组的OD值均较GST组(实验对照)明显降低;其中,MG63的增殖抑制率分别为:25.51%、16.28%和11.63%(P<0.05);U2OS的增殖抑制率分别为:29.41%、15.56%和11.49%(P<0.05)。台盼兰染色活细胞计数实验结果与之一致。(2)Hoechst法检测结果显示:两种细胞在干预24、48和72 h后,GST-hS100A6组与GST组相比,其凋亡率均增加。其中,实验组的MG63细胞的凋亡率较其GST组分别增加135.3%、45.3%和45.8%(P<0.05);实验组的U2OS细胞凋亡率较其GST组分别增加39%、65.1%和78.8%(P<0.05)。(3)划痕愈合实验显示:与GST组比,实验组的MG63细胞在24和48 h的划痕愈合率分别降低24.74﹪和26.25﹪(P<0.05);Transwell实验显示48 h时,实验组穿膜细胞数较实验对照组减少37.6% (P>0.05),两检测方法的结果相符。实验组的U2OS细胞在24和72 h的划痕愈合率分别较实验对照组降低1.6﹪和5.15﹪,无统计学意义(P>0.05)。空白组MG63和U2OS细胞的24 h的划痕愈合率分别为79.74%和17.74%,48 h的划痕愈合率分别为100%和29.03%。提示:外源性hS100A6对MG63和U2OS均有抑制增殖和促进凋亡的作用;hS100A6对MG63有较明显的抑制迁移的作用,但对U2OS细胞迁移能力无明显影响;同时,U2OS细胞的迁移能力可能弱于MG63。5.外源性hS100A6增加骨肉瘤细胞MG63和U2OS中β-catenin表达。(1)用AdS100A6上调MG63和U2OS中S100A6的表达后,细胞中β-catenin mRNA水平分别增加9﹪和37﹪(RT-PCR, P<0.05),β-catenin蛋白表达分别增加31﹪和37﹪(Western blot, P<0.05);免疫细胞化学方法也一致地显示S100A6具有上调β-catenin的作用;同时,β-catenin蛋白的增加在胞浆和胞核均可见到,以胞核增加更为明显。(2)用AdSiS100A6下调S100A6表达后,两株细胞中β-catenin mRNA水平分别减少22﹪和21﹪(P<0.05),β-catenin蛋白表达分别减少38﹪和46﹪(Western blot, P<0.05);免疫细胞化学方法显示β-catenin在胞浆和胞核表达同时减少,以胞核减少更为明显。提示:S100A6可增加人骨肉瘤细胞株U2OS和MG63的β-catenin mRNA水平和蛋白水平,并促进β-catenin向胞核内转移。6.β-catenin减弱S100A6抑制骨肉瘤细胞增殖和迁移的作用,增强其促凋亡作用。(1)β-catenin表达上调后:①S100A6抑制骨肉瘤细胞增殖的作用减弱MTT法的结果提示,β-catenin上调后两株细胞的实验组(Adβ-catenin+GST-hS100A6组)的OD值均较实验对照组(GST-hS100A6组)增加。以MG63的MTT为例:实验组的OD值在48、72和96 h时分别较相应的实验对照组增加69.86%、50%和50.15%(P<0.05)。②S100A6促进骨肉瘤细胞凋亡的作用增强两株细胞实验组的凋亡率(Hoechst染色法)均较实验对照组增加。例如,在24、48和96 h时,MG63实验组的凋亡率分别较实验对照组增加30.25%、48.83%和10.81%(P<0.05)。③S100A6抑制骨肉瘤细胞MG63迁移的作用减弱24和48 h,实验组的划痕愈合率较实验对照组分别增加24.16%和26.25%(P<0.05);Transwell检测时实验组48 h穿过膜的细胞数较GST-hS100A6组增加35.45%(P<0.05)。(2)β-catenin表达下调后:①S100A6抑制骨肉瘤细胞增殖的作用增强MTT结果显示:两株细胞实验组(AdSiβ-catenin+GST-hS100A6组)的OD值均较实验对照组(GST-hS100A6组)降低。例如,MG63实验组的OD值在48、72和96 h时,分别较实验对照组降低15.07%、22.23%和52.97%(P<0.05)。②S100A6促进骨肉瘤细胞凋亡的作用减弱两株细胞实验组的凋亡率均较实验对照组降低。例如:MG63实验组在24、48和96 h时凋亡率分别较实验对照组下降30.25%、48.83%和10.81%(P<0.05)。③S100A6抑制骨肉瘤细胞MG63迁移的作用增强实验组细胞在48 h的划痕愈合率较实验对照组降低5.88%(P<0.05);与之一致的是,实验组48 h的穿过膜的细胞数较GST-hS100A6组减少25%(P<0.05)。本部分结果提示β-catenin影响着S100A6对骨肉瘤细胞的生物学作用:①明显减弱S100A6对骨肉瘤细胞MG63和U2OS的增殖抑制作用;②明显增强S100A6对骨肉瘤细胞MG63和U2OS的促凋亡作用,和③减弱S100A6对骨肉瘤细胞MG63的抗迁移作用。结论1. S100A6对人骨肉瘤细胞株MG63和U2OS均有一定的抑制增殖、促进凋亡的作用。2. S100A6对人骨肉瘤细胞株MG63有明显的抑制迁移的作用,但对U2OS的迁移无明显影响。3. S100A6能够增加人骨肉瘤细胞株U2OS和MG63的β-catenin mRNA水平和蛋白水平,并促进β-catenin向胞核内转移;S100A6在骨肉瘤的高表达可能是导致骨肉瘤中β-catenin增加和其中Wnt/β-catenin信号途径失调的机制之一。4.β-catenin能够明显减弱或拮抗S100A6对骨肉瘤细胞的增殖和迁移的抑制作用,并同时增强S100A6对骨肉瘤细胞的促凋亡作用。5.综上,我们推测: S100A6对骨肉瘤的抑制性作用可能是经由其它信号途径介导的,该途径与S100A6激活的Wnt/β-catenin信号途径相互拮抗,共同精细地调节着骨肉瘤细胞的增殖、迁移和凋亡。本研究为阐明S100A6对骨肉瘤细胞的作用、作用机制以及β-catenin与这些作用之间的关系等提供了实验依据。