手性合成一直是备受关注的热点课题。随着医药、农药及精细化工等相关领域的发展,工业上对于光学纯中间体或合成子的需求量也在不断增加。手性环氧化物和邻位二醇就是其中一类重要的高附加值合成砌块。近年来,生物催化法作为化学合成法的替代方案已显示出低成本和环境友好等优点,符合“绿色工业”和“可持续发展”的社会理念。环氧化物水解酶（Epoxide hydrolase,EH）能够立体选择性地催化外消旋（Racemic,rac-）环氧化物的开环水解,保留单一构型的环氧化物和/或生成相应的邻位二醇,被认为是一种极具潜力的生物催化剂。关于EH新酶的挖掘和应用等方面的研究工作仍然具有着重要的意义。论文从菜豆（Phaseolus vulgaris）中克隆了编码PvEH2的cDNA和基因组DNA序列,实现了PvEH2在大肠杆菌细胞内的表达;测定并分析了PvEH2针对13种单取代环氧化物的催化特性（即底物谱分析）,并在此基础上通过构建新的催化反应媒介（体系）,提高了代表性环氧化物底物的最高浓度;根据计算机的辅助分析,通过片段置换的方法改造PvEH2,研究cap loop区域对于PvEH2催化特性的影响;利用融合突变酶和酶-化学酸联合法分别实现了特定底物的动力学拆分和归一性水解。（1）通过RT-PCR技术从菜豆中克隆出编码PvEH2的cDNA序列,其长度为951 bp,共编码316个氨基酸。氨基酸多序列比对结果显示,PvEH2属于α/β折叠型水解酶超家族。实现了重组PvEH2在大肠杆菌Rosetta（DE3）内的表达,并以rac-环氧苯乙烷（1a）为底物采用单因素和正交试验确定了最佳诱导条件:OD₆₀₀值0.8,IPTG浓度0.2 mmol·L^-1,诱导温度20℃和诱导时间9 h,将产酶活性由17.4 U·L^-1发酵液提高至34.3 U·L^-1。重组PvEH2的最适反应温度和pH分别为30℃和7.0。在稳定性方面,PvEH2在40和45℃的活性半衰期分别约为82和40 min;在pH为6.5⁸.0的体系中较为稳定,25℃下保持2h后的剩余相对活性均在80%以上。动力学参数显示,PvEH2催化（S）-和（R）-1a的K_m与k_cat分别为2.12 mmol·L^-1和18.86 s^-1以及19.65 mmol·L^-1和1.02 s^-1,PvEH2对于（S）-1a的亲和性和催化效率远高于（R）-1a。（2）利用表达有重组PvEH2的大肠杆菌转化子E.coli/Pveh2进行底物谱分析,结果显示,PvEH2对于rac-1a和rac-1,2环氧己烷（13a）的催化活性最高,分别为8.0和7.8U·g^-1湿细胞。除13a外,PvEH2均偏爱于水解S构型底物。对映选择性方面,PvEH2对于rac-1a的对映体选择率（Enantiomeric ratio,E）超过200,是目前已知的所有野生EH中的最高值。PvEH2针对rac-芳基缩水甘油醚类底物（6a¹0a）表现出中等的E值（6.2²3.0）。区域选择性方面,PvEH2对于间硝基环氧苯乙烷（3a）和间氯环氧苯乙烷（5a）具有高且互补的区域选择性,即其区域选择性系数α_S和β_R分别为90.3%和96.4%,以及93.0%和95.8%。以上结果表明PvEH2具有动力学拆分rac-1a和归一性水解rac-3a和rac-5a的潜力。（3）将PvEH2的基因从pET28a（+）转移至冷休克表达质粒pCold II中,构建新的转化子E.coli/pveh2。以rac-1a为底物测得产酶活性由34.3 U·L^-1发酵液提高至82.3 U·L^-1。底物极低的溶解度以及底物和产物的双重抑制作用是造成水相体系中底物浓度低的主要原因。以E.coli/pveh2冻干细胞作为生物催化剂,在5种亲水性和11种疏水性有机试剂中筛选出正辛烷和丙三醇,并构建有机溶剂/缓冲液催化体系。在优化的正辛烷/缓冲液双相反应体系(相体积比v_o·v_a^-1以及rac-1a与细胞的质量比S·C^-1分别为4:6和0.8)中,rac-1a的浓度提高至200 mmol·L^-1,是原单缓冲液体系的10倍,反应获得>99.5%ee_s的（R）-1a,其产率为47.8%,容积生产效率为0.96 g·L^-1·h^-1是目前生物法制备（R）-1a的最高水平。同时还获得93.6%ee_p的（R）-苯乙二醇（1b）,产率与生产效率分别为50.4%和1.16 g·L^-1·h^-1。在含有5%(v·v^-1)丙三醇的缓冲液作为rac-3a归一性水解的反应体系,将最高浓度由原先的10 mmol·L^-1提高至40 mmol·L^-1。在25℃反应12 h时,底物的转化率c值为97.6%,获得84.9%ee_p的（R）-间硝基苯乙二醇（3b）,其产率为90.2%。（4）为提高PvEH2针对rac-13a的对映选择性和探究cap loop对PvEH2催化其它环氧化物特性的影响,基于理性分析的结果将PvEH2的部分cap loop片段与其它四种植物EH（StEH、PvEH1、VrEH1和VrEH2）的相应区域进行替换,构建并表达四种融合突变酶（Pv2St、Pv2Pv1、Pv2Vr1和Pv2Vr2）。底物谱测量结果显示,融合酶的活性出现了不同程度的降低,但Pv2St和Pv2Pv1的比活性基本保持原酶50%以上的活性。片段的替换虽然没有颠换原酶的构型偏好性,但使得E值发生了较大幅度的变化,其中,Pv2Pv1针对rac-1a的E值由>200降至30.9,而Pv2St对于rac-13a的E值则由2.1提高至24.2。此外,PvEH2的区域选择性在融合突变前后没有显著的改变。以表达有融合酶Pv2St的E.coli/pv2st全细胞为催化剂,确定了缓冲液体系内rac-13a的最高反应浓度为280mmol·L^-1。该浓度下的rac-13a能够在4.5 h内被有效拆分,获得>99.5%ee_s的（S）-13a,其最终浓度、产率以及容积生产效率分别为103.3 mmol·L^-1、36.9%和2.30 g·L^-1·h^-1。在此基础上通过酶-化学酸法实现了rac-13a的归一性水解,所获（R）-1,2-二羟基己烷（13b）的ee_p值和产率达到73.0%和86.5%。