背景及目的：　　神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内肿瘤的45％。胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）是最常见的颅内原发性恶性肿瘤，属于胶质瘤WHO分级系统中IV级高级别胶质瘤。临床GBM治疗方案为手术为主联合放化疗，但手术无法完全切除呈浸润性生长的肿瘤。放疗产生的DNA双链断裂（DNA double strand breaks，DSBs）是导致肿瘤细胞凋亡在主要原因，但由于肿瘤细胞对DSBs能进行损伤修复，使得断裂的DNA得以修复，从而治疗效果欠佳。因此 GBM患者的特征是放疗抵抗（radioresistance）、复发率高与平均存活率低。综上所述，本研究的主要目的是深入研究胶质瘤放疗抵抗的分子机理。以往的研究表明GSK3β主要参与肝糖原合成酶磷酸化失活的血糖调节途径，但本研究发现 GSK3β作为重要的 DNA损伤调控因子，参与了GBM细胞电离辐射（ionizing radiation，IR）后的DNA损伤修复。但胞浆蛋白GSK3β是如何参与细胞核内DNA损伤修复以及通过何种信号途径来参与DNA损伤修复，目前尚不明确。　　53BP1是针对产生的DNA双链断裂损伤做出反应的重要调控因子，在胶质瘤细胞中 DSBs信号传递、细胞检验点激活以及 DSBs修复过程中具有多种作用。此前针对53BP1参与DSBs修复的研究，主要集中在其作为p53蛋白与ATM下游分子的作用，53BP1蛋白尚有多个磷酸化激活位点与结构域功能有待进一步研究探讨。此外DSBs修复，是一个多种信号传导机制与蛋白作用的过程，因此进一步阐明53BP1在促进DSBs修复作用、抑制肿瘤细胞凋亡中的具体机制，对于提高神经胶质瘤放疗的敏感性具有重要作用。这提示我们，GSK3β在胶质瘤放疗时，可能完成胞浆到胞核的转移，并参与到53BP1介导的DSBs修复过程，导致放疗抵抗的出现，但其具体分子机制尚待进一步明确。明确 GSK3β调控53BP1参与其介导的DNA损伤修复的具体分子机制，可以为开发以GSK3β为靶点的放疗增敏剂提供理论基础和实验依据。　　方法：　　1、使用自屏蔽137Cs照射器以5 Gy IR总剂量照射U87细胞，通过免疫荧光染色的方法检测GSK3β是否进入细胞核。　　2、通过免疫共沉淀法，检测GSK3β是否与53BP1结合。采用免疫荧光染色法、DNA损伤检测试剂盒与MTT实验来观察检测，GSK3β抑制（化学抑制剂SB216763）或GSK3β基因沉默（siRNA）条件下，U87细胞在电离辐射后的DNA损伤修复情况。初步探究GSK3β参与DSBs修复的分子机制。　　3、通过体内磷酸化实验，检测GSK3β对53BP1的磷酸化作用，同时观察加入GSK3β抑制剂（SB216763）或者将GSK3β基因沉默后以及加入磷酸化酶抑制剂λ-PPase观察53BP1在细胞内被磷酸化的程度。此外，构建带有表达标签的Flag-GSK3β-pBABE-puro重组质粒、GST-53BP1-pcDNA3质粒，转化293T细胞表达重组蛋白，纯化蛋白后进行体外磷酸化实验。通过体内、体外磷酸化实验，探讨53BP1是否被GSK3β磷酸化。　　4、基于体内体外磷酸化结果，初步得出GSK3β磷酸化53BP1这一结论后，进一步探讨53BP1被GSK3β磷酸化的位点。首先通过分子克隆的方法构建含有53BP1各片段的质粒（1-361，302-718，667-1052，986-1353，1052-1709，1703-1972），并经过表达纯化后进行体内、体外磷酸化实验确定53BP1磷酸化片段；确定53BP1被GSK3β磷酸化的片段以后，通过Quick Change定点诱变试剂盒进行用Ala（A）取代Ser（S），对53BP1第166位、176位丝氨酸进行定点突变。观察GSK3β对野生型和突变型53BP1（S166A、S176A）磷酸化作用的差异；通过免疫荧光染色、DNA损伤检测与MTT实验这三种研究方法，进一步从阐述GSK3β磷酸化53BP1参与DSBs修复的具体机制。　　5、构建荷瘤鼠模型，设置对照组、IR组、SB216763组与SB216763+IR组；记录荷瘤鼠的皮下移植肿瘤的体积、直径与重量，用TUNEL原位染色观察细胞原位凋亡；记录荷瘤鼠的体重以及100天生存率。从体内、体外水平，评价GSK3β磷酸化53BP1在DNA损伤修复中的重要性，为GSK3β抑制剂研发成为放疗增敏剂提供科学依据。　　结果：　　1、电离辐射后，GSK3β从胞浆转移到胞核；GSK3β进入细胞核以后与53BP1结合，参与促进γ-H2AX、Mre11、NBs1等DNA损伤修复因子的聚集；GSK3β抑制后能显著提高U87细胞对电离辐射诱导DSBs的敏感性与细胞增殖率、降低DNA损伤百分比。GSK3β被抑制和基因沉默后，能抑制DNA损伤修复诱导细胞凋亡。　　2、电离辐射后，GSK3β从胞浆转移到胞核，与53BP1结合并磷酸化53BP1。体外带有表达标签的 Flag-GSK3β与 GST-53BP1磷酸化实验结果表明，GSK3β与53BP1结合，并且磷酸化53BP1。将GSK3β活性抑制后，则53BP1被磷酸化程度明显降低。　　3、通过构建不同片段的53BP1，进行体内体外磷酸化实验，结果表明GSK3β磷酸化53BP1的片段位于 N1（1-361）段。进一步通过点突变的方法，观察到53BP1被GSK3β磷酸化的位点是166位丝氨酸（Ser）。通过损伤修复下游信号通路蛋白γ-H2AX、Mre11、NBs1的免疫荧光染色、DNA损伤检测以及细胞增殖检测，观察到166位Ser突变的53BP1，抑制DNA损伤修复，进一步揭示GSK3β磷酸化53BP1的166位Ser，从而促进DNA损伤修复。　　4、通过体内荷瘤鼠实验，观察到与对照组以及单独使用IR或GSK3β抑制剂（SB216763）相比，SB216763+IR组荷瘤鼠的肿瘤的体积变小、直径变短、重量减轻，并且 TUNEL染色可见明显的 DNA断裂凋亡。除此以外， SB216763+IR组小鼠体重逐步增加，存活率明显升高。　　结论：　　在胶质母细胞瘤中，电离辐射诱导 DSBs，GSK3β能从胞浆转移到胞核与53BP1结合，并磷酸化53BP1的166位Ser，促进DNA损伤修复。而GSK3β抑制剂能显著提升U87细胞对放疗的敏感性，因此GSK3β可作为GBM放疗增敏的关键靶点。