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目的:骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种全身性代谢性骨病,是目前世界上发病率、死亡率及保健费用消耗较大的疾病之一。据统计全世界目前约有2亿人患有骨质疏松。骨质疏松症发病常“静悄悄”,“不知不觉”,一旦发现多已经发展到一定程度,因此越来越引起人们的重视。从细胞学水平上来研究骨质疏松的发病机理及其药效评价已经成为基础与临床研究的热点。成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡在维持骨的正常结构和代谢中具有重要作用。骨质疏松是由于骨吸收和骨形成解偶联,骨吸收大于骨形成导致骨量丢失而引起。大量资料显示:成骨细胞的增殖抑制、分化程度降低是造成骨质疏松的重要原因。中医药学(TCM)认为骨与肾的关系密切,其在预防和治疗骨质疏松及骨折方面存在着悠久的历史。祖国医学古典医籍《黄帝内经》中,有很多类似于骨质疏松的名称的记载,历代也有不少治疗骨质疏松的名方。本实验中补肾方药由熟地黄、淫羊藿、山药、丹参、骨碎补、独活组成。有效部位的单体化合物依次是梓醇、淫羊藿苷、薯蓣皂苷元、丹参酮ⅡA、柚皮苷、羟甲香豆素。细胞培养技术(Cell culture technique),是生命科学研究中一个必不可少的技术。我们多次酶消化-贴块法对SD大鼠原代成骨细胞的体外培养,而获得足够数量的成骨细胞。首先观察成骨细胞在生长过程中的形态学变化,进而以体外培养的SD大鼠成骨细胞5~6代为实验对象,采用补肾方药不同单体配伍、生药配伍、淫羊藿苷单体进行成骨细胞干预性培养,在不同浓度、不同时间及不同配伍的情况下,采用噻唑蓝法(MTT)和对硝基苯二钠基质动力学法(pNPP)分别对大鼠成骨细胞的增殖与分化进行测定。通过比较和观察补肾方药不同配伍对成骨细胞的增殖和分化的影响,从而初步确定补肾方药及其组分配伍有效性及其有效浓度范围。方法:1、我们选用新生(<24h)SD大鼠颅盖骨为试验材料,采用多次酶消化-贴块法对大鼠原代成骨细胞的体外培养。倒置显微镜下对原代成骨细胞形态学变化进行观察;2、补肾方药的配伍分组:依据中医基础理论和方剂学配伍规律将补肾方药中“地黄+淫羊藿+山药”和“骨碎补+丹参+独活”各分为一类,即:“补药”(Tonics Medicine,TMed)和“泻药”(Cathartic Medicine,CMed)。“补药”(TMed)和“泻药”(CMed)分为生药(Crude Drug)(原药直接提取的成分)和单体(monomer)(有效化学成分)两种,称为“补药生药配伍组(crude Tonics Herbs Compatibility Groups,cTHCG)”和“泻药生药配伍组(crude Cathartic Herbs Compatibility Groups,cCDCG)”,分别用“CT”组和“CC”组表示;“补药单体配伍组(monomer Tonics Drug Compatibility Group,mTDCG)”和“泻药单体配伍组(monomer Cathartic Drug Compatibility Group,mCDCG)”分别用“MT”和“MC”表示。补肾方药的试验分组:分8组,①CT>CC组,②CT=CC组,③CT<CC组,④空白组(BlankGroup,BG),⑤MT>MC组,⑥MT=MC组,⑦MT<MC组,⑧淫羊藿苷组(Icariin Monomer Group,IG)。3、补肾方药配伍的用药比例:“补药”(TMed)>“泻药”(CMed):地黄:淫羊藿:山药:骨碎补:丹参:独活(2:2:2:1:1:1);“补药”(TMed)=“泻药”(CMed):地黄:淫羊藿:山药:骨碎补:丹参:独活(1:1:1:1:1:1);“补药”(TMed)<“泻药”(CMed):地黄:淫羊藿:山药:骨碎补:丹参:独活(1:1:1:2:2:2);4、用噻唑蓝比色法(MTT)法测成骨细胞的增殖;加入浓度各为10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml的补肾方药及中药单体;继续培养24h、28h、72h后,加入MTT 20μl,用酶标仪测定OD值,观察对大鼠成骨细胞增殖的影响。5、用对硝基苯二钠基质动力学法(pNPP)测定大鼠成骨细胞的分化;换上补肾方药及中药单体,加药浓度各为10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml后;继续培养24h、28h、72h后,吸弃培养液,加入0.25ml 0.1%Triton溶液,按试剂盒说明测定,结果以每克蛋白中碱性磷酸酶(ALP)的国际单位(U/g protein)表示,该方法通过对ALP含量的测定,进而可反映OB的分化情况。结果:1、多次酶消化-贴块法大鼠原代成骨细胞的体外培养的形态学观察1.1倒置显微镜下观察发现,原代成骨细胞由大鼠颅盖骨周爬出,贴壁、展开,呈多边形、三角形;刚接种的成骨细胞呈球形,24h内存活细胞已沉降贴壁,完全展开,呈三角形、梭状形,核明显增大;传代培养5天,细胞形态可见多样化;培养8~15天,可见长索性、多角形、条索形,汇合时细胞呈铺路石状,可重叠生长;15天后,可出现胶原堆积和钙盐沉积。1.2碱性磷酸酶染色可观察到成骨细胞酶活性部位呈现紫色细颗粒状。2、MTT法测定补肾方药对大鼠成骨细胞的增殖2.1与对照组相比,浓度为10ng/ml时,在24 h测定MT>MC组增高(P<0.05);在48h测得CT>CC组, CT=CC组, MT>MC组,有明显促增殖作用(P<0.05);在72 h浓度下,MT>MC组具有显著促增殖作用(P<0.05);2.2与对照组相比,浓度为20ng/ml时,在24 h测定CT>CC组和MT>MC组有促增殖作用(P<0.05);在48h测得CT>CC组、MT>MC组具有促增殖作用,以CT>CC组明显(P<0.05);在72 h,CT>CC和MT>MC组具有促增殖作用(P<0.05);2.3与对照组相比,浓度为30ng/ml下,在24 h测定CT>CC组有明显促增殖作用(P<0.05);在48h测得CT>CC组,MT>MC组,MT<MC组具有促增殖作用(P<0.05);在72h浓度下,CT>CC组促增殖作用强(P<0.05);3、对硝基苯磷酸二钠基质动力学法(PNPP)测定补肾方药对大鼠成骨细胞的分化影响3.1与对照组相比,浓度为10 ng/ml时,在24 h是测定MT>MC组ALP增高P<0.05);在48h测得MT>MC组有明显促ALP作用(P<0.05);在72h测得结果,MT>MC组,MT=MC组的ALP含量明显升高,(P<0.05);3.2与对照组相比,浓度为20ng/ml时,在24 h测定CT>CC组、CT=CC组、MT>MC组和MT=MC组有促ALP作用(P<0.05);在48h和72 h测定ALP的含量, CT>CC组有明显的促ALP分泌作用(P<0.05);3.3与对照组相比,浓度为30ng/ml下,在24h是测定CT>CC组、MT>MC组有促ALP分泌作用,CT>CC组较明显(P<0.05);在48h和72 h测得CT>CC组有促明显的促ALP分泌作用(P<0.05);结论:1、补药单体配伍组>泻药单体配伍组(MT>MC)在10ng/ml浓度72h时测得的结果最高,推断低浓度的单体配伍对大鼠成骨细胞的增殖和分化具有促进作用;2、补药单体配伍组>泻药单体配伍组(MT>MC)可能具有量-效和时-效关系。推断其量效关系为:随着浓度(剂量)的增加对大鼠成骨细胞的增殖和分化作用反而减弱;同一浓度下,24h与72h相比较推断其时-效关系:72h时具有明显的促进成骨细胞增殖和分化的作用;3、补药生药配伍组>泻药生药配伍组(CT>CC)在30ng/ml时具有促进成骨细胞增殖和分化的作用,推断其量-效和时-效关系为:随着浓度(剂量)和时间的增加对大鼠成骨细胞的增殖和分化作用而增强;4、补药>泻药(TMed>CMed)的配伍关系,对成骨细胞具有更好的干预效果;就本方剂来讲起效部位可能是梓醇、淫羊藿苷、薯蓣皂苷元、丹参酮ⅡA、柚皮苷、羟甲香豆素之间的配伍;补肾方药由熟地黄、山药、淫羊藿、丹参、骨碎补、独活生药之间的配伍优于单体有效成分配伍,可能在生药配伍之中还有其他未知的成分;5、中药方剂的复杂性来源于在中药配伍的过程中新产生的或者含有其他未知的成分。通过本实验的研究为中药方剂学的研究进行了有益的探索,为中医学和中西医结合基础和临床提供一个实验性思路和方法。