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在‘平潭水仙’开花过程中,本研究利用HS-SPME-GC-MS分离分析技术,结合保留值、内标法进行了挥发性芳香物质定性定量分析;利用XAD-2树脂吸附法以及有机溶剂成功分离了游离态、键合态芳香组分,并在外源β-葡萄糖苷酶的水解作用释放了键合态芳香物质,检测到了挥发性芳香物质;同时利用丙酮粉法研究了β-葡萄糖苷酶活性变化趋势,并克隆分离了四个β-葡萄糖苷酶基因家族成员和一个芳樟醇合成酶基因家族成员,进行了荧光定量表达分析,所得主要结果如下: 1.1、‘平潭水仙’不同时期挥发性物质分析 自水培之日(0d)起至现绿色花苞(19d),‘平潭水仙’均未释放挥发性物质,随着花苞转白到完全绽放,挥发性物质种类及含量随之不断增多,后伴随着花的衰老,挥发性物质也相应减少。‘平潭水仙’花主要的挥发性物质是萜烯类、醇类、酯类,以Z-罗勒烯、芳樟醇、乙酸苯甲酯、别罗勒烯为主,其中芳樟醇是贡献最大的特性香气组分,其次为罗勒烯,两组分均随着花的盛开,含量显著增加,进入衰老期又急剧降低。 1.2、‘平潭水仙’不同时期游离态、键合态芳香物质分析 在‘平潭水仙’花盛开过程中,19d的绿芽虽未检测到太多的游离态芳香物质,却富含较多的键合态芳香物质;随着花的盛开,游离态的芳香物质组分增多,键合态芳香物质较少;进入衰老期游离态芳香物质减少而键合态芳香物质变多。 1.3、‘平潭水仙’不同时期β-葡萄糖苷酶活性变化 随着花的盛开,酶活显著提高至27d达到最大值,伴着花的衰老酶活又逐渐降低。β-葡萄糖苷酶活性的动态变化趋势与‘平潭水仙’挥发性芳香物质的变化趋势一致,初步推测了β-葡萄糖苷酶与‘平潭水仙’挥发性芳香物质形成的关系,即随着花的盛开,初期贮存的键合态芳香物质在逐渐提高活性的β-葡萄糖苷酶的水解糖苷键作用下,不断释放出具有芳香物质的配基,增加了花的游离态芳香物质,从而增加了水仙花的香味,后伴随着花的衰老,酶活性降低,水解糖苷键的作用减弱,芳香物质多以键合态的形式存在,致衰老过程中花的挥发性芳香物质也随之减少。 1.4、β-葡萄糖苷酶基因家族成员、芳樟醇合成酶基因克隆和表达分析 本研究尝试克隆β-葡萄糖苷酶基因家族成员和芳樟醇合成酶基因,成功克隆了3个(Nt-BGLⅠ-1、Nt-BGLⅠ-2、Nt-BGLⅠ-3)属于糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶基因家族成员和1个(Nt-BGLⅢ-1)属于糖基水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶基因家族成员,核酸序列长度在1665~2155bp,编码区为1464~1878bp,编码487~652个氨基酸,5’UTR序列长度均比3’UTR短;克隆分离出一条芳樟醇合成酶基因(Nt-Lis I),全长为1668bp,开放阅读框(ORF)大小为1575bp,编码524个氨基酸,有一个DDXXD基序,无RRx8W基序,可能属于TPSg家族成员。根据实时荧光定量分析结果推测主要由Nt-BGL I-1、Nt-BGL I-3参与了‘平潭水仙’挥发性芳香物质形成过程,Nt-BGL I-2、Nt-BGLⅢ-1参与了β-葡萄糖苷酶其他生理代谢;萜类合成酶众多,本论文所获得的芳樟醇合成酶基因(Nt-Lis I)可能并不是参与芳樟醇合成途径的关键基因家族成员。