论文部分内容阅读
多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs）的稳定性导致其易在环境介质中不断累积,其挥发性则使其能经自然沉降实现远距离迁移,极大威胁生态安全。土壤是PAHs最大的汇,有效清除土壤中的PAHs是当前的热点。PAHs的微生物修复因具备环保、高效、经济等特点而备受推崇。然而,在实际应用中,游离的降解菌细胞难以迅速适应新环境,且外源菌在与土著微生物的竞争中常处于劣势而难以成功定殖。由于生物炭具有稳定的多孔结构,可为外源降解菌提供良好的繁殖场所;且其对污染物的强烈吸附效应可增加负载其上的菌株与污染物的接触机会。因此,近年来,利用生物炭作为修复菌剂载体的固定化菌剂技术备受关注。鉴于此,本研究首先从实验室前期富集到的菲反硝化厌氧菌群中分离、纯化兼具好氧和厌氧菲代谢能力的菌株,并考察环境因子对菌株生长及降解菲的影响,以确定菌株代谢菲的最佳环境条件。在此基础上,用PCR检测菌株是否含有PAHs代谢的相关基因,并用GC-MS对典型菌株代谢菲的中间产物进行了鉴定,从而推测该菌株可能的菲降解途径。随后,以获取的菌株为对象,开展接种菌株及负载生物炭菌株的玉米和水稻盆栽试验,以考察获取的菲降解菌株及其生物炭固定化对旱地（玉米）及水田（水稻）土壤菲去除及作物生长的影响。最后,采集各盆栽处理的土壤样品并提取DNA,通过基于16S r DNA的Illumina Mi Seq测序来解析其中的细菌群落组成;进而考察接种外源菌及使用生物炭对旱地及水田土壤细菌群落结构的影响,并综合分析上述因子的微生态效应。旨在为具备菲代谢能力菌株的生物炭固定化应用提供理论支撑,同时也为深入探究生物炭固定化微生物对PAHs等有机污染物的降解机理打下基础。主要研究结果如下:（1）分离纯化到两株兼具有氧和厌氧菲代谢能力的菌株,命名为PHE-3和PHE-4,它们分属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas sp.）。有氧及厌氧条件下,PHE-3和PHE-4代谢菲的最佳p H均为7.0,最适温度分别为25℃和30℃。在50~200 mg·L-1菲初始浓度范围内,2株菌的菲降解率均随菲浓度的升高而急剧降低,且菲降解率与其生长量呈正相关。当菲初始浓度为50 mg·L-1时,21 d内,PHE-3和PHE-4在有氧条件下对菲的降解率分别为52.92%和53.01%,而厌氧条件下的菲降解率均高于有氧,分别可达75.62%和71.08%。此外,在PHE-3有氧培养14 d的培养液中检测到特异性中间产物2（1H）-Naphthalenone,3,4,5,6,7,8-hexahydro-1,1-dimethyl和1,2,4,5-Benzenetetracarbonitrile,且该菌可能含有PAHs代谢相关的phd A、pah Ac基因;据此推测PHE-3可能具有两条不同的菲降解路径,一是环羟基化双加氧酶（RHDs）首先在1、2号碳原子上催化菲为亲水性衍生物,随后催化苯环上C-C键裂解实现开环;其二则在9、10号碳位间位切割开环,随后经过一系列酶促反应实现菲的矿化。在PHE-3厌氧培养14 d的培养液中检测到特异性中间产物9,10-Ethanoanthracene,9,10-dihydro和N-（9-Fluorenylmethoxycarbonyloxy）succinimide,表明该菌厌氧代谢菲的反应可能起始于菲分子9、10位碳原子的加成反应,随后经加成或取代反应实现进一步转化。（2）在获取到菲代谢纯菌株的基础上,本部分通过旱地（玉米）及水田（水稻）盆栽试验,探索目标菌株及其生物炭固定化菌剂在土壤菲去除中的效果及其对作物生长的影响。试验设计如下:玉米（M）及水稻（R）盆栽均设置高(H:80mg·kg-1)和低(L:50 mg·kg-1)两个土壤菲含量处理组,各组下分别设未接菌且不添加生物炭（P）,只添加生物炭（B）,接种PHE-3（M）,接种生物炭固定化的PHE-3（BM1）及接种生物炭固定化的PHE-3和PHE-4（BM2）5个处理。玉米盆栽低菲和高菲处理组的5个处理分别记为:LP-M、LB-M、LM-M、LBM1-M、LBM2-M和HP-M、HB-M、HM-M、HBM1-M、HBM2-M;水稻盆栽低菲和高菲处理组的5个处理分别记为:LP-R、LB-R、LM-R、LBM1-R、LBM2-R和HP-R、HB-R、HM-R、HBM1-R、HBM2-R。培养3个月后,采集各处理土壤样品,并测定土壤菲含量和土壤多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）、土壤脱氢酶（Soil Dehydrogenase,SDHA）及土壤脲酶（Soil Urease,SUE）活性;同时收集植物样品,测定作物干重和相关的应急酶（过氧化物酶:Peroxidase,POD;细胞色素P450酶:Cytochrome P450,CYP450）活性及丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量。结果表明:玉米和水稻盆栽中,接种菌株PHE-3处理的菲去除率与不接种且未添加生物炭处理相比无显著差异,而其余含生物炭的各处理的菲去除率均显著降低,表明接种菌株未能显著提高土壤菲去除率,且生物炭的添加不利于土壤菲的去除;添加生物炭及负载降解菌的生物炭对土壤PPO活性无显著影响,但能在一定程度上提升旱地土壤的SDHA及SUE活性。添加生物炭（含负载菌剂的生物炭）显著提升了旱地土壤作物（玉米）的干重,但对水田作物（水稻）无显著影响;添加生物炭和负载菌剂的生物炭对植株（玉米和水稻）POD活性无显著影响,但只添加生物炭能分别抑制和提升低菲和高菲处理组玉米的CYP450活性,且只添加生物炭能使植株（玉米和水稻）的MDA含量显著降低。（3）土壤微生物与土壤的功能及肥力密切相关,是赋予土壤“生命”特征的重要因子。因此,在上一章考察了接种菲降解菌或稻壳生物炭负载的菌剂对土壤菲去除及作物生长的影响的基础上。本章中,以上述盆栽试验结束后的土壤样品为对象,提取DNA,用Illumina Miseq测序解析各处理土壤的细菌群落组成。探究生物炭负载菌剂对受菲污染的旱地（玉米）及水田（水稻）土壤微生物的生态效应。结果表明:接种菌剂或添加生物炭均未显著影响玉米和水稻盆栽土壤细菌的α-多样性,但旱地土壤细菌的Shannon指数与其土壤菲去除率呈显著负相关（R~2=0.186,P=0.017）;直接接种菌剂或接种生物炭负载的菌剂均有利于提升旱地土壤中与目标菌株（PHE-3）近缘的Pseudomonas的相对丰度;接种菌剂或添加生物炭均能显著影响旱地及水田土壤细菌群落结构,且细菌群落结构与土壤菲去除率及作物干重均显著相关。