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鸭病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis, DVH)又称鸭肝炎,是由鸭病毒性肝炎病毒(Duck Hepatitis virus, DHV)引起的一种急性、高度致死性的传染病,以肝炎为主要特征,主要发生于三周龄以下雏鸭。近年来该病的发病率和死亡率不断上升,严重危害了养鸭业的健康发展。鸭肝炎病毒有三个血清型,分别引起I型、II型和III型鸭肝炎,其中I型和III型属于小RNA病毒科,II型属于星状病毒科。国内外主要流行I型鸭肝炎。本研究利用3′RACE方法扩增并克隆了4株鸭肝炎病毒(DHV)(ZYM株、Z05株、Z07株和Z10株)的基因组的3′末端真实序列,包括部分非结构蛋白(3D)基因以及紧接着3D基因下游的3′端非编码区(untranslated region,UTR)和poly(A)尾巴。测序结果表明,扩增的特异性片段长度为597 nt(不包括polyA尾巴)。各毒株3′UTR均为314 nt,位于终止密码子TGA之后,比对分析结果表明各毒株间的同源性较高;4株DHV3′末端核苷酸序列(不包括polyA尾巴)之间的同源性为96.3 %～100 %,而与参考毒株之间的同源性为93.5 %～99.7 %。在系统发生进化树上,各毒株亲缘关系较近。根据己发表的I型鸭病毒性肝炎病毒(Duck virual hepatitis virus type I, DHV-I)的基因组序列,设计并合成了覆盖DHV-I全基因组序列的8对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增得到了DHV-I Z10株基因组的各片段,其中病毒基因组3′末端序列的扩增是通过RACE方法得到。将扩增产物分别克隆于pMD-18T载体中进行测序,测序结果拼接后,进行BLAST在线同源搜索,确定为I型鸭肝炎病毒基因组序列,并利用分子生物学软件对Z10株序列组成,以及DHV的分子演化关系等进行辅助分析。序列分析表明Z10株全基因组由7688个核苷酸组成,基因组中只含有一个大的阅读框架(ORF),编码2249个氨基酸,多聚蛋白裂解位点比较保守,最终形成12个成熟的蛋白,依次为VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A -3B-3C-3D。对Z10株全基因组序列与GenBank上发表的6株DHV基因组全序列进行比对,比对结果表明,Z10株与DHV-I CL株亲缘关系最近,核苷酸序列一致性为98.4 %;与H株核苷酸序列同源性最低,为95.3 %。与03D株序列比对显示,Z10株没有发生碱基插入或缺失;且在其基因组5’端有一个长达626 nt的非编码区(NCR),3’NCR含有314个核苷酸(不包括poly(A)尾巴)。根据GenBank中已登录的DHV VP1基因的序列设计1对引物,采用RT-PCR方法成功地扩增出4株I型鸭肝炎病毒(DHV) (分别命名Z05、Z06、Z07、Z10)的VP1全基因的cDNA片段,将4个cDNA片段分别克隆到pMD18-T Vector载体中进行序列测定,得到4个毒株VP1基因的序列。应用分子生物学软件分析其与目前GenBank上发表的具有代表性的DHV-I VP1基因的遗传变异,分析结果表明4株I型鸭肝炎毒株VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸。经比对分析得知4株DHV-I之间VP1基因的核苷酸序列相似性93.0 %～99.7 %,氨基酸序列相似性为95.4 %～100 %;与参考毒株的VP1基因的核苷酸序列相似性91.2 %～99.7 %,氨基酸序列相似性为94.5 %～98.7 %,各毒株的亲缘关系较近。根据VP1的氨基酸序列,绘制了不同DHV-I分离株的系统进化树。结果显示,其中3株浙江分离株属于同一基因群,VP1氨基酸变异主要表现为羧基端出现多处氨基酸置换,提示VP1可能含有DHV-I的毒力相关的位点。本试验从基因水平上研究病毒的进化情况,揭示与其他毒株的亲源关系,分析其基因型,为该病在流行病学和预防控制方面的研究奠定基础。根据已知的基因组序列,设计、合成了1对能快速检测DHV-I的特异性引物,并建立了DHV-I的RT-PCR检测方法。与传统的DHV-I检测方法相比,该方法具有快速、敏感和高度特异性等技术优势,可应用于DHV-I的流行病学调查和临床诊断等。