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MiRNA是由基因组编码的一类长度为18~27nt的单链小分子RNA。它们一般由60~70 nt的前体加工而来,没有开放阅读框,也不编码任何蛋白质,一般通过调控靶基因的表达水平来发挥其生物学功能。MiRNA在各个物种间具有高度的进化保守性。大多数miRNA具有组织特异性表达和发育阶段特异性表达的特点,这些特点暗示了miRNA可能参与了非常复杂的基因表达调控过程,并且在植物的生长发育和响应外界环境胁迫的过程中发挥着重要作用。
MiRNA可以在转录水平和转录后水平调控基因表达。MiRNA在转录后水平上对基因表达调控主要通过介导靶基因mRNA的剪切和抑制靶基因mRNA的翻译两种方式。而miRNA在转录水平上的基因调控报道较少,有研究认为,在植物中,miRNA可能通过影响基因编码区的甲基化状态来调控基因表达。受技术手段的限制,目前对miRNA作用方式的研究尚不完全,可能还存在新的作用方式。
本研究利用生物信息学和现代生物学实验技术,鉴定可能靶向启动子进而在转录水平上影响基因表达的miRNA,以探索新的miRNA作用方式,主要结果如下:
(1)通过分析miRNAs与靶基因序列之间的互补性和二者形成复合体的热稳定性,使用生物信息学方法筛选出106个可能作用于启动子区域的拟南芥miRNAs,它们可能靶向超过500个启动子位点。
(2)从预测到的miRNA中,挑选了miR171b,miR396b和miR400三个miRNA进行进一步实验验证。通过瞬时转化拟南芥原生质体的方式,发现miR171b,miR396b的过量表达会导致预测到的相应靶基因的启动子驱动的GUS报告基因表达量的上调。
(3)在miR171b和miR396b的超表达植株中检测靶基因的表达量,发现相应靶基因的表达量较野生型同样表现出上调,证明它们在拟南芥植株中同样可以调控靶基因的表达。
(4)通过拟南芥表观遗传学修饰图谱发现,在大部分预测的miR171b和miR396b的靶基因启动子区域,均存在不同程度的表观遗传学修饰现象,暗示这两个miRNA肯能通过调控启动子区域的表观遗传学修饰状态来在转录水平上影响基因表达。通过检测在一些RNA介导的DNA甲基化途径成员突变体中靶基因表达水平,发现miRNA可能会通过表观遗传学的方式调控靶基因的表达。
(5)通过qRT-PCR检测预测到的miRNA和其靶基因在高盐和干旱条件下的表达,发现miR396b在高盐和干旱条件下表达量均有明显上升,其靶基因AT1G18870和AT3G47640的表达量同样表现出上调趋势,暗示miRNA在转录水平上对基因表达的调控可能在植物胁迫响应过程中发挥着重要作用。