急性免疫性肝损伤临床表现为乏力、纳差、上腹部不适、黄疸、发热、肝区疼痛等，可归为中医“胁痛”、“黄疸”等病范畴。大量临床与实验研究表明，中药可通过多途径实现对肝损伤的保护作用，其机制与改善肝脏微循环、拮抗内毒素、对抗肝细胞凋亡、抑制炎性细胞因子以及清除自由基等有关。目前，急性免疫性肝损伤病理机制仍不十分明确，中药治疗免疫性肝损伤的作用机理，尤其是中药对细胞凋亡、信息传导与细胞间的相互作用的研究鲜见报道。肝康颗粒(Gankankeli，GK)是导师彭勃教授根据中医学理论与多年临床实践的大量研究，并不断优化而成的纯中药复方制剂，治疗上强调益气健脾，补益肾肝，清热解毒，祛湿化瘀多法的原则，随证加减。 刀豆蛋白A(ConA)诱导的小鼠急性肝损伤是近年来新建立的T细胞介导的免疫性肝损伤模型，是深入研究肝细胞损伤的细胞生物学与分子生物学机制，以及进行实验研究筛选的理想动物模型[1]。 本研究探讨免疫性肝损伤的发病机制及GK颗粒对其防治作用，为临床用药提供理论依据。 目的：本研究采用ConA诱导小鼠急性免疫性肝损伤模型，通过观察动物症状及体征变化、检测肝指数、脾指数和生化指标评估肝损伤情况；取肝组织匀浆检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平含量；酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量；原位末端标记法(TUNEL法)观察肝细胞凋亡情况；免疫组化染色法(IHC法)观察Fas和FasL表达情况；透射电子显微镜(TEM)观察肝细胞超微结构；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析肝组织半胱胺酸蛋白酶-3mRNA(Caspase-3mRNA)表达水平，综合评价GK颗粒对上述指标的影响。 第一部分肝康颗粒对ConA诱导急性免疫性肝损伤模型小鼠血清ALT、TBIL水平及一般体征的影响 目的：观察GK颗粒对ConA诱导急性免疫性肝损伤小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)及肝、脾指数的影响，探讨其拮抗免疫性肝损伤及保护肝细胞的作用。 方法：Balb/c小鼠，雄性100只，体重25g～28g，随机均分为5组，即空白对照组、模型组、GK颗粒低剂量组(7.5g/kg，相当于临床拟用量的15倍)、GK颗粒中剂量组(10g/kg，相当于临床拟用量的20倍)、GK颗粒高剂量组(12.5g/kg，相当于临床拟用量的25倍)。空白对照组和模型组分别给予生理盐水，GK颗粒低、中、高剂量组，灌胃不同程度的GK颗粒药液，每天1次，连续7天。各组动物于实验第7天(禁食14h，不禁水)，末次给药后1h，除空白对照组外，小鼠尾静脉注射ConA20mg/kg，空白对照组小鼠尾静脉注射等体积无菌PBS。观察记录各组小鼠一般体征和死亡率。6h后眼眦静脉取血，2500rpm离心，分离血清，测定血清ALT、TBIL水平。迅速解剖小鼠，肉眼观察肝脏、脾脏的外形、色泽、质地及其大体形态，万分之一天平称重，计算肝、脾指数。实验期间每天观察统计各组小鼠一般体征状况和死亡情况。 结论：本研究结果显示GK颗粒各组死亡率、脏器指数、ALT、TBIL测定值均明显降低，表明GK颗粒可拮抗ConA诱导的肝损伤作用。 第二部分肝康颗粒对ConA诱导急性免疫性肝损伤模型小鼠肝匀浆SOD活力和MDA水平的影响 目的：研究ConA诱导肝损伤模型小鼠自由基及质膜损伤的程度，探讨GK颗粒对ConA诱导肝损伤模型小鼠抗氧化防御体系的作用。 方法：小鼠随机分组与方法同上。空白对照组和模型组分别给予生理盐水，GK颗粒低、中、高剂量组灌胃给药，每天一次，连续7天，第7天后禁食不禁水14h。除空白对照组外各组末次给药后1h，于小鼠尾静脉注射ConA20mg/kg，6h后立即剖取肝组织约500mg，放置冰生理盐水中清洗，用滤纸吸干后称重，置玻璃匀浆器中加入9倍冰生理盐水，在冰浴中进行研磨。充分匀浆后3500rpm离心10min，取上清液以1：9的比例稀释成1％的肝组织匀浆液。分别按试盒方法测定肝匀浆液MDA水平和SOD活力。 结论：GK颗粒具有减轻机体和肝细胞的抗氧化系统ConA的破坏，提高机体内抗氧化酶系的活性，有效清除肝损伤时产生的自由基，保护肝细胞不受自由基和脂质过氧化损伤，减轻肝损伤的程度。 第三部分肝康颗粒对ConA诱导急性免疫性肝损伤模型小鼠血清TNF-α水平的影响 目的：探讨TNF-α在肝损伤中的作用机制，及GK颗粒对ConA诱导急性免疫性肝损伤模型小鼠TNF-α水平的影响及其意义。 方法：酶联免疫吸附实验(ELISA法)检测TNF-α含量。 第四部分肝康颗粒对ConA诱导急性免疫性肝损伤模型小鼠肝脏组织形态的影响 目的：观察ConA诱导急性免疫性肝损伤小鼠肝脏组织形态的改变，从形态学角度观察GK颗粒对急性免疫性肝损伤小鼠的作用。 方法：苏木素-伊红染色法(HE法)观察小鼠肝脏组织变化，原位末端标记法(TUNEL法)检测肝细胞凋亡指数，免疫组化染色法(IHC法)观察Fas和FasL表达情况。 结论：ConA诱导急性免疫性肝损伤模型小鼠肝损伤病理形态表现为肝细胞内出现脂肪变性和弥漫性水样变，肝血窦内瘀血，间质有大量炎性细胞浸润。肝细胞凋亡程度严重，细胞凋亡指数明显升高。Fas和FasL表达明显增加。GK颗粒各组对上述病变具有不同程度的抑制作用，随剂量增加疗效增强，高剂量组效果尤为明显。表明GK颗粒对ConA诱导小鼠急性免疫性肝损伤具有拮抗作用。 第五部分肝康颗粒对ConA诱导急性免疫性肝损伤模型小鼠肝脏组织超微结构的影响 目的：观察ConA诱导急性免疫性肝损伤模型小鼠肝组织超微结构的改变，研究GK颗粒对免疫性肝损伤模型小鼠肝细胞线粒体、内质网、染色质的影响及对肝细胞凋亡的影响。 方法：透射电子显微镜观察肝细胞超微结构的改变，立体计量学测定相关指标。 结论：GK颗粒可减轻ConA诱导急性免疫性肝损伤模型小鼠肝细胞线粒体、内质网、染色质的损伤，有效下调肝细胞凋亡，拮抗肝损伤。 第六部分肝康颗粒对ConA诱导急性免疫性肝损伤模型小鼠肝脏Caspase-3mRNA表达的影响 目的：观察Caspase-3mRNA基因在ConA诱导肝损伤模型小鼠肝组织中的表达、肝细胞凋亡的情况以及GK颗粒对其的影响。 方法：用RT-PCR半定量分析肝组织中Caspase-3mRNA表达水平。 结论：GK颗粒能有效降低或延迟肝细胞Caspase-3mRNA的表达，影响蛋白酶级联切割过程，进而减轻或抑制ConA肝损伤小鼠的肝细胞凋亡，发挥拮抗肝损伤之作用。