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本研究中SelenoproteinWmRNA和蛋白的下调采用RNA干扰技术,首先根据目的mRNA翻译区序列合成了21bp长的,具有特殊结构要求的双链siRNA,参照文献记载,选取对小鼠骨骼肌细胞转染效率较高的阳离子脂质体Lipofactamine为转染试剂,使其与合成的siRNA形成复合体,利用胞饮和范德华力作用机理,将复合体导入小鼠骨骼肌细胞;当复合体成功进入细胞后,利用细胞所特有的机制,与细胞内特殊蛋白形成沉默复合物,发挥剪切作用,达到降解目标mRNA的目的。随后,利用蛋白印记和荧光实时定量PCR技术对细胞模型中的目标基因及其表达蛋白的动力学变化进行研究,细胞状态的变化由流式细胞术进行测量。转染效率通过转染荧光标记的与目标序列无同源性的siRNA进行报告。本研究平行地在原代细胞和传代细胞进行。
在针对C2C12细胞系中SelW基因的RNA干扰实验中,最高的干扰效率见于转染后24小时,本实验的转染效率为50%至70%。
在阳性小RNA效能比较实验中,选取生物学特性稳定的传代细胞作为实验材料,实验用细胞依转染不同的两个合成的siRNA分为组1,组2,并按转染试剂推荐的常规剂量,分别转染1ug小RNA。24小时和48小时后分别进行流式细胞术检测。
在剂量反应检测实验中,选取实验证明具有良好效果的1号siRNA进行实验,将肌细胞分为6组,分别对应6个梯度进行实验,以便依次梯度降低SelWmRNA水平,考察针对小鼠骨骼肌细胞的合适转染剂量。每组依次转染2ug,1.5ug,1.2ug,1ug,0.5ug,0.25ugsiRNA,各组依次按1~6编号。24小时后分别进行检测。
在2个合成siRNA干扰效能比较实验的基础上,在实验确定了小鼠肌细胞最适的siRNA转染剂量后,进行了干扰效率检测实验,实验设立阳性组、阴性组和空白对照组3组,分别转染1号阳性siRNA、阴性siRNA(各lug)和不转染siRNA(不转染任何外来物质仅进行培养基更换)。
上述所有实验都进行后续检测,包括:流式细胞术、定量PCR和Westernblot,分别针对实验用细胞状态、目的基因和蛋白的变化。
结果:
1.两个合成siRNA都可以引起RNA干扰,但从流式细胞术检测到的其引起细胞凋亡结果看,二者的工作效能存在差异,1号(31.7%)优于2号(14.5%),因此1号siRNA选做后续实验之用。转染后24小时为最佳检测时段。
2.在传代细胞剂量反应实验中,当转染剂量为2ug,1.5ug,1.2ug时,会导致50%至70%的细胞层脱落,细胞死亡过多导致细胞无法回收,使测定无法进行;当转染剂量为1ug,0.5ug,0.25ug时,流式细胞术检测发现,凋亡率分别为32.5%,12.4%,6.58%;上述3组中SelWmRNA的量通过标准曲线法实时定量PCR进行了测定,分别是0.25,0.39,0.524;对蛋白检测时,假定组6中SelW蛋白的量为50,组4,5,6中蛋白的相对量为:17.26,31.08和50。所有证据指出,1ugsiRNA为最适合剂量,可以激发最高的干扰效率,并在细胞健康与转染干扰之间维持平衡。
3.在传代细胞RNA干扰效率检测实验的流式细胞术检测结果表明,最高的凋亡率发生在RNA干扰效率检测实验中,为37.5%(阳性组);与阴性对照组(0.93%)和空白对照组(0.7%)相比差异显著,分别为P=3.08×10-9<0.05,P=2.95×10-9<0.05。实时定量PCR检测结果也显示,阳性组细胞中SelWmRNA的量(0.275)与空白对照组(0.996)相比也下降了72.4%;阴性对照组(0.9867)与空白对照组(0.996)相比下降了0.93%。蛋白含量变化的测定中,假定空白对照组中SelW蛋白的量为标准(100),则阳性组的SelW蛋白的相对量为:25.07;阴性对照组的SelW蛋白的相对量为:98.75;与空白对照中蛋白量相比,阳性组与阴性组的量分别下降了74.93%,1.25%。
值得指出的是,实施于原代细胞的剂量反应实验、RNA干扰效率检测实验结果与传代细胞相似,只是因干扰而引起的量的改变相对较弱:剂量反应实验中,转染过量siRNA导致细胞死亡;转染1ug,0.5ug,0.25ug时,凋亡率为18.3%,8.1%,4.3%;SelWmRNA量为0.22,0.25,0.32;蛋白含量为39.5,46.2,50;RNA干扰效率检测实验中,阳性组、阴性组、空白对照组的凋亡率分别为20.0%,1.03%,0.4%;目的基因量平均为0.534,0.663,0.67;蛋白含量为41.2,48.8,50。
实验证明,一、在小鼠骨骼肌细胞代谢过程中,SelenoproteinW蛋白缺失会诱发细胞凋亡,SelenoproteinW蛋白的功能之一为凋亡抑制剂,揭示硒缺乏性肌病的病理机制并非仅组织变性、坏死一个途径。二、RNA干扰存在着阈值效应,即转染siRNA达到相应剂量后才会产生理想的干扰效果,这对于借助RNA干扰技术实施抗病毒和基因治疗都具有非常现实的意义。三、RNA干扰效率与基因丰度无关。虽然骨骼肌细胞中SelW基因表达量相对较低,但实验证明RNA干扰同样可以产生显著结果,支持不同基因对于抗RNA干扰存在着遗传差异性理论。四、原代细胞的RNA干扰更趋向于保守。来自于原代细胞的所有各组的相应实验结果都显示,发生于原代细胞的RNA干扰效率低于传代细胞,产生原因要求进一步的研究。