从附着生物分泌的粘附物质中开发新型、稳定、高效且可在水环境中使用的粘合剂是当今研究热点之一。其中,藤壶（Balanus）因粘附过程不依赖于多巴分子系统和复杂的氨基酸修饰,具有很强的粘附力和抗冲刷特性,是开发水下高性能仿生粘附剂的理想材料。然而,天然藤壶胶蛋白分泌量少且易聚合,获取困难,需要大量样品,导致成本极高,因此,如何大量制备藤壶胶已成为亟待解决的科学问题。体外基因重组技术为制备藤壶粘胶蛋白提供了可行的技术方案。在众多的表达宿主中,毕赤酵母（Pichia pastoris）作为公认的异源蛋白高效表达优良宿主,已成功高效异源表达了多种蛋白。为此,本研究以红巨藤壶（Megabalanus rosa）的主要粘胶蛋白Mrcp20K为研究对象,通过与米根霉脂肪酶融合表达、增加基因剂量、共表达辅助蛋白并结合高密度发酵等多种策略,将Mrcp20K蛋白表达量提高到克级表达水平,是目前已报道粘胶蛋白表达量的最高水平,为藤壶粘胶蛋白的工程化应用提供了有力的技术支撑。本研究的主要内容和结果如下:（1）将红巨藤壶Mrcp20k基因序列连接到pPICZαA载体上,将pPICZαAMrcp20k基因以单拷贝的形式转化毕赤酵母X-33宿主,摇瓶发酵取上清,通过考马斯亮蓝法测得平均粗蛋白表达量为62±3.50 mg/L。（2）运用“生物砖”法,成功构建了1、2、3、4拷贝基因的pPICZαA-Mrcp20k载体,转化毕赤酵母X-33宿主,摇瓶发酵,上清液的粗蛋白表达量最高可达172±7.60mg/L。选取蛋白表达量最高的克隆子X-33/pPICZαA-4Mrcp20k 4#进行摇瓶发酵条件优化,在优化条件甲醇诱导时间96 h、诱导温度25℃、摇瓶初始接种量3%、甲醇添加量1.5%、培养基初始pH7.0下,上清液粗蛋白表达量提高到182±4.18 mg/L,较优化前提高了5.8%。（3）为进一步提高Mrcp20k在毕赤酵母中的表达量,采用融合表达策略将Mrcp20k与米根霉脂肪酶proROL进行融合表达,以能在一定程度上利用proROL的表达分泌途径。将融合蛋白proROL-Mrcp20k的基因序列连接到pAOαN-ROL载体上,并运用“生物砖”法,成功构建了1、2、3、4拷贝基因的pAOαN-proROL-Mrcp20k载体,转化毕赤酵母GS115宿主,摇瓶发酵,含4拷贝基因的重组菌GS115/pAOαN-4proROL-Mrcp20k上清粗蛋白表达量最高,可达410±10.00 mg/L,为单拷贝重组菌GS115/pAOαN-proROL-Mrcp20k（210±5.50 mg/L）的1.95倍,提高显著。（4）在4proROL-Mrcp20k中加入Bmh2、SSO2、Ssa4和VHb四种辅助蛋白因子共表达,将pAOαN-4proROL-Mrcp20k-Bmh2-SSO2-Ssa4-VHb转化毕赤酵母GS115宿主,摇瓶发酵上清粗蛋白表达量可达621±9.00 mg/L。选取蛋白表达量最高的克隆子GS115/pAOαN-4proROL-Mrcp20k-Bmh2-Sso2-Ssa4-VHb 8#进行摇瓶发酵条件优化,在优化条件甲醇诱导时间96 h、诱导温度25℃、摇瓶初始接种量3%、甲醇添加量1.5%、培养基初始pH7.0下,摇瓶发酵上清粗蛋白表达量进一步提高到629±8.36mg/L。将优化后的菌株GS115/pAOαN-4proROL-Mrcp20k-Bmh2-Sso2-Ssa4-VHb在50-L发酵罐中进行高密度发酵,发酵上清粗蛋白表达量可达7.60 g/L。同时,对Mrcp20K和重组ROL-Mrcp20K蛋白进行了初步表征实验,XPS分析结果显示两者在铝片上均具有一定的粘附性。