前言:肝癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国列第四位，每年30万人死于肝癌，占癌症死亡率的第二位，其1、3、5年生存率分别为66.1％、39.7％和32.5％。外科手术切除术被公认为是首选治疗方法[1]。但是，由于发病早期并无明显异常，多数病人就诊时已经为中晚期，失去了外科手术机会。特别是肝癌治疗过程中，常常受到肿瘤大小、数目、分布，血管侵犯、局部解剖情况以及肝功能储备等因素的影响，仅有20％左右的的患者能够接受外科手术治疗[2,3]。　　微波消融治疗(Microwave Ablation，MWA)是近年来发展起来的一项针对实体肿瘤，特别是原发性或转移性肝癌的微创介入治疗技术，由于其创伤小、疗效确切、适应证范围广泛，越来越受到人们的重视。多项临床研究证实，对于小肝癌，微波消融治疗具有媲美外科切除术的中远期疗效[4，5，6，7，8]。随着临床研究的不断深入，微波消融技术本身存在的问题逐渐凸显出来，治疗后肿瘤细胞残余是其中最突出的问题，由此而引起的局部肿瘤复发成为影响肝癌微波消融治疗中远期疗效的重要因素之一。文献报道肝癌微波消融后的局部复发率为2％-60％，显著高于外科手术[9,10]。一项荟萃分析[11]通过95篇报道的5224个肝癌病灶微波消融治疗分析局部复发的原因，结果显示导致局部复发率增高的重要影响因素是肿瘤体积大、包膜下肿瘤和靠近大血管的肿瘤。分析具体原因如下:①肿瘤体积较大时，尽管设计的布针方案会尽可能的包含整个肿瘤，但是很多情况下消融的“盲点”仍很难避免[12];②由于热消融治疗原理为热效应沉积而导致肿瘤凝固性坏死，肿瘤内部血供丰富，血液流动所致的热量流失最终会使血管周围成为肿瘤细胞残存、复发的源地，而进行肝动脉栓塞或阻塞肝静脉可使血流减慢，增大消融面积[13];③靠近肝被膜的肿瘤，特别是临近胆管、胆囊、膈肌、胃肠道时，操作者常常会因担心副损伤而使消融的范围不足以达到临近被膜的肿瘤。外科入路恰好可以避免这些副损伤而提高完全消融率，减少复发[14]。　　多年以来，人们一直在不断改进技术和设备、努力寻求新的方法来减少微波消融治疗后肿瘤细胞的残存，降低局部复发率。近年来的研究进展主要集中在以下三个方面:①微波消融设备本身的改进。微波电极针的改进增加了消融范围，可使消融范围达到5-6cm[15]。冷循环电极针的出现有效的解决了因微波针周围组织碳化影响电磁波传递和针道肿瘤细胞残余的问题[16]。②引导技术的进步。根据肿瘤的形态，在影像设备如超声、CT等的引导下利用多针进行合理的布针方案，可以对较大的肿瘤进行完全消融。近几年，影像融合技术和虚拟导航系统的发展使得经皮穿刺的精准度大大提高[17]，这也使肿瘤的完全消融率得到提高。③引入其他辅助的治疗手段或处理措施。在消融治疗前栓塞肿瘤供血血管以及应用血管活性药物等方法可以减少血流带来的热效应流失，增加消融范围[13]。人工腹水或人工胸水可以将肿瘤和邻近的危险器官（肺、胆囊、肠管等）分离，增加超声的透声窗，提高危险部位肿瘤的消融率[18]。然而，尽管肝癌微波消融治疗的疗效有所提高，由于微波消融技术本身的原理和技术特点所限，消融后肿瘤细胞残存和肿瘤局部复发问题仍然没有得到实质性的解决。　　坏死亲和剂是一类能和坏死组织形成稳定结合的物质，利用这一特性，人们将其应用在坏死相关性疾病的诊断、定位和示踪成像等方面。心肌梗死的靶向磁共振成像是较早和较为集中的研究方向之一，利用该化合物的坏死亲和特性，连接顺磁性物质后注射至体内，便可在磁共振成像时使梗死心肌强化显像。随着研究的进行和不断深入，坏死亲和剂的特性逐渐被揭示出来，该类物质经静脉注射后可高度选择性的沉积在坏死组织内，与其中的某些基团形成稳定的结合，其作用机制尚不清楚[19,20]。前期研究证实，金丝桃素（一种多年生草本植物-贯叶连翘的提纯物）是一种具有极强坏死亲和性的天然小分子化合物，其无毒性和副作用。而且在PH中性环境下，可被放射性碘原子同位素高纯度标记[19,20,21,22]。　　Li等在大鼠的R1肝癌模型中利用血管坏死靶向剂(Combretastatin A-4Phosphate，CA4P)造成肿瘤中心坏死，再注射123I-金丝桃素，48小时后肿瘤坏死区的放射性强度是肿瘤组织的11倍，是正常肝脏的28倍，而且在9-12天的观察期内，肿瘤坏死区内有持续性的放射性浓聚[23]。以往报道肝癌的靶向内照射治疗药物，如131I-美妥昔单抗[HAb18 F(ab)2]是利用抗原抗体反应实现与肝癌细胞靶向性结合，但是其肿瘤内放射性强度仅为非肿瘤区的2-3倍，远远低于金丝桃素[24]。这些实验数据和结果为我们提出针对肝癌微波消融治疗后残余肿瘤的治疗新策略奠定了理论和技术基础。　　凝固性坏死是肿瘤微波消融治疗后的主要存在形式，残存的肿瘤细胞分散在坏死组织中间或是周边，如果以坏死为靶点对残存的肿瘤进行治疗可能是一种较好的治疗模式，并最终可能突破微波消融技术本身的“瓶颈”使得肝癌微波消融治疗的疗效得到突破性的提高。针对目前肝癌微波消融后局部复发率高的临床问题，基于前期的研究基础，我们提出新的设想:利用对坏死组织具有极强亲和能力的坏死亲和剂金丝桃素，标记治疗性放射性核素131I后注射至体内，该复合物靶向性的沉积到消融后凝固性坏死组织内，在肿瘤内部和周边形成持续性的放射性环境，其放射性强度、照射范围、持续时间将杀灭肿瘤内部和边缘的残存肿瘤细胞，达到根治性放射治疗的效果，而由于其高度的靶向性和适形性，对周围正常组织影响很小。为了验证上述研究设想和进一步深入探讨其作用的分子机制，我们建立大鼠原位移植性肝癌模型，利用微波消融诱导坏死靶点的产生，然后经静脉注射131I-金丝桃素，通过SPECT-CT成像、γ计数、放射自显影、显微荧光成像等手段评价131I-金丝桃素对微波消融后凝固性坏死的靶向性。通过活体MR成像测量肿瘤体积随时间的变化，绘制肿瘤生长曲线，计算肿瘤倍增时间，评价靶向放射治疗对于微波消融后残余瘤的治疗效果并推测可能的分子机制。研究结果将为治疗肝癌微波消融后的残余肿瘤、降低局部复发率提供新的方法，为明确其作用机制提供理论和实验依据。　　材料和方法:实验1:本研究采用Iodogen氧化法标记金丝桃素。首先称取1mgIodogen固体溶于1mL二氯甲烷中，震荡摇匀后用移液枪取出50uL加入到1.5mL容量的Eppendorf管中，然后用氮气将管内液体吹干制备成Iodogen管备用。用移液枪分别向制备好的Iodogen管中加入14.8MBq的Na13I溶液、1×10-7mol Hyp及300μL DMSO，室温下放置反应30分钟，随后将混合物用Sep-Pak C18小柱进行纯化。先用2mL蒸馏水洗去游离131I，后用1mL甲醇将产物自小柱上洗脱下来，利用高效液相检测标记率。高效液相采用流动相为甲醇及0.04％醋酸铵缓冲盐，洗脱体积比为88∶12。　　移液枪移取标记好的0.1mL131I-Hyp（200μCi，7.4MBq）至0.9mL大鼠血清中，在37℃下恒温孵育。分别于0h及72h取出500μL并向其中加入300μL乙醇，充分振荡后离心(12000rpm，8min)，然后用高效液相检测其稳定性，洗脱条件同上。　　实验2:选择体重250-300g的健康雄性SD大鼠30只，麻醉后开腹经肝穿刺种植法在肝左叶种植约1mm3的新鲜Waker256瘤块，接种后每3天进行MR平扫，采用小动物专用线圈，分别进行T1WI、T2WI扫描(层厚2mm，间距0.1mm)，直至肿瘤体积达到治疗要求（肿瘤最大径0.8±0.2cm）。再次开腹后应用微波针(针长180mm，外径1.9mm，前极5mm，频率2450MHz)对肝肿瘤进行偏心性消融治疗，采用连续消融模式，功率10W，消融时间1min，诱导微波消融后的凝固性坏死和残余瘤出现（控制消融边缘，使残余瘤体积约占整个肿瘤的25％左右）。　　微波消融治疗后24h进行残余瘤的鉴定，分别采用T1WI、T2WI和T1WI增强扫描，造影剂使用Gd-DTPA（钆双胺）50μmol/kg经尾静脉注射。活体成像完成后处死动物，取肝脏标本切片并行常规HE染色，切片需包括正常肝组织、残余肿瘤组织及坏死肿瘤组织，显微镜下选取合适视野并拍照。将MRI图像与病理切片图像进行对比，判定残余瘤是否达到既定要求。　　实验3:取体重250-300g的肝脏荷瘤雄性SD大鼠30只，分为三组，每组10只。三组分别为联合治疗组，微波消融对照组及空白对照组。联合治疗组先行微波消融，24h后经尾静脉注射131I-Hyp（74MBq/kg）。微波消融对照组先行微波消融，24h后经尾静脉注射等量溶剂DMSO。空白对照组先行假手术（大鼠接受完全相同的开腹术和微波针的插入，但无微波能量的释放），24h后经尾静脉注射等量溶剂DMSO。所有大鼠给药前三天均接受卢戈氏溶液(KI1.2g/L)封闭甲状腺，一直持续到实验结束。所有动物分别于0d，1d，4d，8d行MR扫描动态观察肿瘤大小变化，联合治疗组于3d，8d(给药后2d，7d)行SPECT-CT扫描观察放射性核素的聚集部位。所有大鼠于9d全部处死，肝脏标本取材切片并行HE染色。联合治疗组分别于2d，5d，9d（给药后1d，4d，8d）处死三只大鼠，标本取材分别行放射自显影、γ计数及显微荧光成像，用以评价131I-Hyp对微波消融后凝固性坏死组织的靶向性。　　结果:实验1:本实验采用Iodogen氧化法标记Hyp，经高效液相检测，131I-Hyp标记率超过90％。经纯化后，131I-Hyp的比活度达5～10Ci/mmol，经RP-HPLC检测，放化学纯度可达到98％。在37℃恒温孵育72h后，经放射性HPLC检测131I-Hyp的放化学纯度依然高于95％。　　实验2:本实验采用开腹经肝种植肿瘤，所有30只大鼠均顺利成瘤(成瘤率100％)，其中1只大鼠出现广泛腹腔转移。二次开腹经行偏心性微波消融，24h后增强MR扫描示大鼠肝脏肿瘤可见明显的新月形强化（体积约25％）及大片无强化坏死肿瘤组织（体积约75％），符合既定要求。HE染色切片镜下亦可见明显的具有活性的肿瘤组织及无活性的坏死肿瘤组织，与正常肝组织分界明显，且与MRI图像完美匹配。　　实验3:在整个观察期内，联合治疗组的肿瘤生长明显慢于微波消融对照组及空白对照组，三组的肿瘤倍增时间分别为12.13±1.99d，4.09±0.97d，3.36±0.72d，且结果具有统计学差异。联合治疗组大鼠于3d，8d（给药后2d，7d）行活体SPECT-CT扫描结果显示在给药后2d及7d，肝脏坏死肿瘤处可持续出现放射性核素浓聚。联合治疗组分别于2d，5d，9d(给药后1d，4d，8d)处死三只大鼠，标本取材分别行放射自显影、γ计数及显微荧光成像。磷屏放射自显影结果显示给药后1d，放射性核素主要集中在坏死肿瘤，但正常肝组织亦有少量分布。随着时间的推移（给药后4d，8d），放射性核素逐渐向坏死组织聚集，且在正常肝组织内迅速清除。γ计数结果显示在给药后4d，放射性物质主要集中在肺、大肠、活瘤及坏死肿瘤。而在给药后8d，放射性物质则基本集中在坏死肿瘤组织，结果具有明显的统计学差异。显微荧光成像结果显示在给药后1d，红色荧光主要分布在坏死肿瘤，但正常肝组织亦有微弱的荧光分布。随着时间的推移(给药后4d，8d)，红色荧光逐渐向坏死组织聚集且在正常肝组织内分布逐渐减少，与磷屏放射自显影结果相一致。　　结论:1、本实验采用Iodogen氧化标记法标记金丝桃素，经放射性HPLC检测，该法稳定性良好，标记率高，且131I-Hyp在离体大鼠血浆中孵育72h后的放化学纯度依然高于95％，说明其体外稳定性良好。2、本实验中的大鼠先后接受两次开腹，第一次为瘤块的种植，成瘤后再次开腹行偏心性微波消融，最后通过影像学及病理学手段来验证残余瘤的存在。经鉴定，该方法稳定可行、成模率高，为后续的联合治疗实验提供了可靠的动物模型。3、本实验证实了131I-Hyp对微波消融所致的大鼠肝癌坏死组织具有良好的靶向性，且随着时间的推移，该靶向性逐渐增加。文献中曾描述射频消融可导致针道周围的组织产生“幽灵现象”或者“热固定”，本实验证实了微波消融亦具有该现象。131I-Hyp对大鼠肝癌微波消融后残余肿瘤的生长具有明显的抑制作用，该协同抗肿瘤效应为实体瘤的治疗提供了新的思路。