WRKY家族基因是近些年来研究较为广泛的一类植物转录因子,它在高等植物中存在较广,在低等植物中很少发现。WRKY家族成员不仅可以参与植物的多种生物学过程,如代谢调控、形态建成、种子萌发等,在生物和非生物胁迫条件下也会不同程度被诱导,表明了在植物防卫反应中WRKY蛋白扮演着不可或缺的角色。本研究克隆白桦WRKY家族基因及其启动子,研究其表达特性,筛选和抗逆性及材性相关的WRKY家族成员,进行功能研究,为林木分子生物学提供基础理论,为培育速生、优质、高抗白桦新品种提供材料。本研究在前期构建的白桦转录组中查找到131条WRKY基因,利用NCBI网站中的blastx程序进行比对分析,最终确定37条具有完整开放读码框(ORF)的白桦WRKY基因序列,利用PCR技术进行扩增,成功克隆得到20条白桦WRKY基因,并对其进行了生物信息学分析。结果表明它们都含有高度保守的WRKY氨基酸结构域,并且很多都与拟南芥中的AtWRKY遗传进化关系较近。利用实时荧光定量PCR技术研究了白桦WRKY家族基因在白桦不同组织及不同非生物胁迫下不同时间点的基因表达模式,结果表明这些基因在不同组织中的表达是具有特异性的,在叶片中的表达量普遍较高。在不同的非生物胁迫下呈现出不同的表达趋势,在同一非生物胁迫下的不同时间点表达量也有一定的差异。综合表达模式分析及生物信息学分析结果,本文选取白桦BplWRKY6基因作为后续实验的主要研究对象。将白桦BplWRKY6基因与GFP基因融合构建植物表达载体,利用基因枪法转化到洋葱表皮细胞中研究BplWRKY6蛋白的亚细胞定位,结果表明BplWRKY6蛋白定位在细胞核内。对已克隆出的20个WRKY家族基因利用白桦基因组数据进行启动子查找,克隆了其中17个基因的启动子并测序成功,通过PLACE网站对其启动子序列上可能存在的顺式作用元件进行预测,检测到多个与逆境胁迫响应相关的元件,推测基因与逆境胁迫响应相关。用BplWRKY6等4个基因的启动子定向替换表达载体pBI121-GUS中的35S启动子,构建了启动子驱动GUS的植物表达载体。利用瞬时侵染系统将重组载体转化整株的野生型白桦实生苗,进行GUS染色分析,结果显示白桦叶片、茎段和根部均有不同程度的染色,说明克隆到的BplWRKY基因的启动子不仅能够启动报告基因的表达,而且具有一定的组织特异性。将已克隆出的20个WRKY家族基因中的5个基因构建到过表达载体pROKⅡ,并对BplWRKY6基因进行抗逆性功能研究。利用蘸花法进行拟南芥的转基因实验,通过抗性筛选和PCR分子检测最终得到了 20个纯合子的BplWRKY6过表达株系,观察转基因拟南芥的表型。结果显示生长速度和发育情况在初期并无明显差别,但最终过表达株系的株高要明显低于野生型,抽茎时间也更为延后。用100 mmol/L NaCl和200 mmol/L Mannitol分别对野生型植株和过表达株系胁迫24 h,非生物胁迫实验结果显示在两种非生物胁迫下转基因株系的种子萌发率和根长均要低于野生型;利用DAB、NBT和Evans Blue的进行生理染色,结果显示BplWRKY6基因过表达后,植株活性氧的释放增多,细胞受损程度增大。说明BplWRKY6基因对于白桦抵抗非生物胁迫具有负调控作用。在此基础上,使用瞬时转化系统对野生型白桦实生苗进行瞬时侵染,利用实时荧光定量PCR技术研究过表达BplWRKY6基因对抗性相关基因表达的影响,结果显示SOD、POD等与抗性相关的基因在瞬时转化后都呈现出不同程度的下调表达。暗示BplWRKY6基因通过抑制白桦抗性相关基因的表达在植物抵抗非生物胁迫中起到负调控作用。为研究BplWRKY6蛋白的转录自激活活性,构建了酵母表达载体pGBKT7-BplWRKY6。结果显示在SD/-Trp/-His/X和SD/-Trp/-His/-Ade/X两种缺陷型固体培养基上的菌落均变为蓝色,表明BplWRKY6蛋白具有自激活活性。根据BplWRKY6蛋白保守区预测结果,将基因分为四个片段,分别构建到酵母表达载体pGBKT7,以确认具有自激活活性的片段所在位置。结果表明,BplWRKY6蛋白具有自激活活性的片段位于前1-50个氨基酸序列中。