研究背景及目的食管支架置入术后再狭窄的发病率高，严重影响了支架的应用，成为临床工作中的难点[1]。食管支架置入术后发生良性再狭窄的主要原因是成纤维细胞的被动活化与过度增殖，导致肉芽组织增生及纤维化的发生[2]，可见成纤维细胞增殖与凋亡的失衡是食管再狭窄发生的关键因素。在细胞凋亡的相关信号通路中，死亡受体介导的信号通路是其主要途径之一。其中，肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(tumor necrosis factor receptorassociated death domain protein，TRADD)在肿瘤坏死因子-α (TNF-α)介导的细胞凋亡信号通路中发挥着重要作用。TNF-α的大多生物活性是通过TNF受体1(TNF-reptor1，TNFR1)诱导实现的，TRADD与TNFR1的结合是TNF/TNFR1介导的细胞凋亡信号转导通路中公认的重要步骤之一。TRADD同其他凋亡结合蛋白一样，具有死亡域(death domain, DD)结构。TNF-α首先与TNFR1结合，进而使位于胞浆中游离的TRADD通过其DD区域与TNFR1尾部的死亡域DD连接，再依次激活下游靶分子蛋白，从而将TNF-α诱导的程序性死亡信号传导下去，最终引起细胞凋亡。Sayah等[3]通过比较瘢痕疙瘩和正常瘢痕组织中64个凋亡相关基因的表达情况时，发现TRADD是病理性瘢痕疙瘩中低表达的八个基因之一。由此推测：TRADD基因的低表达使TNF-α介导的细胞凋亡通路受到明显抑制，从而导致增生性瘢痕成纤维细胞的过度增生。慢病毒(Lentivirus)载体是来源于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的一种病毒载体，具有表达稳定、感染效率高、自身抗原性弱、可操控性强、容纳外源目的基因片段大以及可感染非分裂期与分裂期细胞等优点[4,5]，在诸多转基因技术中有着不可比拟的优势。近年来，在基因治疗相关领域的研究中，构建同时能提供高效的基因转移率、稳定的基因表达和长期可靠的生物安全性的慢病毒转移载体技术已成为研究的热点[6,7]。基于以上的研究背景，本实验通过构建携带TRADD基因的慢病毒过表达载体，以增生性瘢痕成纤维细胞(hypertrophic scar fibroblast，HSFb)为研究对象，以培养的正常胚胎成纤维细胞(normal fetal fibroblast，NFFb)和正常表皮细胞(Hacat)为对照，在TRADD过表达慢病毒分别转染三组细胞的基础上，加入TNF-α(10ng/ml)至培养基中刺激细胞。观察各组细胞的生长情况，分析并阐述外源性TRADD融合蛋白和TNF-α对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响及其机制。试图为食管支架置入术后再狭窄的基础与临床研究提供理论帮助和新的防治策略。研究方法1.构建携带TRADD基因的慢病毒过表达载体：以购买的TRADD目的基因为模板，通过PCR扩增目的片段，将PCR产物与EcoR I酶切线性化的表达载体pLVX-EGFP-3FLAG-Puro进行同源重组。质粒共转染293FT包装细胞制备慢病毒，最后采用Real-Time定量PCR法检测病毒滴度。2.通过采用细胞免疫荧光法、Western blot法检测TRADD在未进行慢病毒转染的HSFb、NFFb中的蛋白表达水平。3.选择最佳感染指数(MOI值)后，进行慢病毒转染HSFb、NFFb及Hacat。并采用Western blot法定性检测转染后TRADD-GFP-FLAG融合蛋白的表达情况。4.三组细胞分别分成六组：未转染组(空白组)、未转染+TNF-α组(空白组+TNF-α)；转染对照病毒组(对照组)、转染对照病毒+TNF-α组(对照组+TNF-α)；转染TRADD慢病毒组(实验组)、转染TRADD慢病毒+TNF-α组(实验组+TNF-α)。采用MTT法检测各组细胞在慢病毒转染前后以及协同10ng/ml TNF-α药物浓度诱导前后的细胞增殖情况。实验结果1.成功构建TRADD基因慢病毒表达载体，病毒滴度为3.22×108IU/ml。2.细胞免疫荧光法和Western blot法检测结果显示：内源TRADD在HSFb中的蛋白表达量明显低于NFFb中的表达量，两组间比较有显著性差异(P＜0.05)。3.慢病毒转染HSFb、NFFb和Hacat的感染指数MOI100时，转染效率最高，约80%，因此最佳感染指数为MOI100。在此条件下进行TRADD慢病毒转染细胞后，Western blot法检测显示：TRADD-GFP-FLAG融合蛋白能够得到有效的表达，可用于后续实验研究。4.采用MTT法检测不同组间细胞生长情况，结果显示：(1)NFFb：从24h开始，对照组细胞增长速度明显快于空白组和实验组，实验组和空白组的细胞生长速度无明显差异；10ng/ml TNF-α药物浓度对细胞的生长无明显抑制作用。(2)HSFb：三组细胞生长速度从快到慢依次为：对照组，空白组，实验组；10ng/mlTNF-α药物浓度对细胞的生长无显著影响。(3)Hacat：空白组细胞生长速度显著快于对照组和实验组，48h后，实验组和对照组细胞生长速度无明显差异；在72-96h内，10ng/ml TNF-α药物浓度对空白组、对照组和实验组细胞有促进作用。实验结论1.成功构建TRADD基因慢病毒过表达载体，在增生性瘢痕成纤维细胞、正常胚胎成纤维细胞和Hacat中表达的TRADD-GFP-FLAG融合蛋白具有生物学活性。2.在增生性瘢痕成纤维细胞中，内源性TRADD蛋白表达量显著低于其在正常胚胎成纤维细胞中的表达量，提示TRADD可能参与了增生性瘢痕的形成。3.10ng/ml TNF-α药物浓度对增生性瘢痕成纤维细胞和正常胚胎成纤维细胞的增殖无明显作用，对Hacat细胞的生长有显著的促进作用。4.过表达TRADD-GFP-FLAG融合蛋白可抑制成纤维细胞增殖活性，对Hacat细胞无影响。提示在成纤维细胞中，TRADD是TNF-α介导的细胞凋亡信号通路中重要的分子之一；在Hacat细胞中，TRADD则不是该通路中的关键分子。5. TRADD慢病毒感染两种成纤维细胞后，TRADD的蛋白表达均显著上调，MTT结果显示TRADD慢病毒选择性抑制了增生性瘢痕成纤维细胞的增殖，对正常胚胎成纤维细胞的生长无显著影响。提示死亡蛋白TRADD蛋白的大量表达，可能激活TNF-α介导的两种诱导反应——凋亡和NF-κB激活引起的细胞存活。在生理情况下，两条通路之间存在着某种平衡机制，使细胞的增殖与凋亡尽量维持正常状态。