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目的:研究促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)对新生儿窒息后血清诱导人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的保护作用及机制。方法:(1)以HK-2为研究对象。(2)以窒息后第一天20%(体积分数)血清作为攻击因素。(3)第一阶段实验共分为对照组、窒息组和EPO组,EPO组设立5个浓度亚组,探讨EPO是否具有保护作用及最适保护浓度。(4)第二阶段实验以最适保护浓度预处理细胞,攻击前分为空白对照组和EPO预处理组,在攻击后15min,1h,2h分为相应时间的血清攻击组和EPO预处理组后血清攻击组。(5)检测指标:第一阶段实验在倒置相差显微镜下观察细胞的形态学改变,生化法检测培养上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率和MTT法检测细胞活力变化;第二阶段实验通过激光共聚焦显微镜观察间接免疫荧光染色NF-κB转位以及免疫印记(Western blot)检测NF-κB抑制亚基I-κBα量的变化。(6)统计学处理:所有数值以均数±标准差(x±S)表示,实验组各时间点进行单因素方差分析,组间进行LSD检验。P<0.05为差异有显著性。采用SPSS12.0统计软件完成。结果:(1)倒置相差显微镜下观察HK-2细胞生长状况:对照组细胞贴壁良好,透明度大,折光性强,呈扁平的多角形,分裂相多,细胞排列紧密,连接成片,数量多。窒息组细胞生长缓慢,细胞数量比对照组明显减少,细胞形态发生改变,由典型的扁平多角形细胞变为不规则圆形或椭圆形,折光性减弱,轮廓增强,胞质中出现空泡,脂滴,颗粒样物质,细胞间空隙加大,连接松散,细胞间可见较多细胞碎片。EPO组:随浓度的增加,细胞损伤明显得到改善,当浓度≥50IU/ml时与对照组相似。(2)与对照组(63.49±1.30%)相比,窒息组LDH漏出率(76.37±1.32%)明显增加,在EPO组,除EPO 1IU/ml(76.04±1.50%)组外,各浓度EPO与窒息组比较,差异均有统计学意义(p<0.05)。EPO组随浓度的增加保护效果逐渐增强,LDH漏出率逐渐减小,EPO 100IU/ml( 64.55±1.28%),50IU/ml(64.40±1.84%)组与对照组无统计学差异(p>0.05)。(3)与对照组(0.642±0.018)相比,窒息组细胞活力(OD值)(0.240±0.036)明显降低。除EPO 1IU/ml(0.240±0.044)组外,各浓度EPO与窒息组比较,差异均有统计学意义(p<0.05)。EPO组随浓度的增加保护效果逐渐增强,EPO 100IU/ml(0.624±0.018),50IU/ml(0.620±0.016)组与对照组无统计学差异(p>0.05)。(4)攻击前与空白对照组(9.7±2.1%)相比,EPO预处理组NF-κB核转位率(20.0±2.6%)显著增加;而血清攻击后各组与空白组对照组比较,NF-κB核转位率显著增加,以攻击后1小时最明显;各时点EPO预处理组后血清攻击组与血清攻击组相比, NF-κB核转位率显著减少。(5)攻击前与空白对照组(0.52±0.05)相比,EPO预处理组I-κBα/β-actinIOD比值(0.26±0.03)显著减少;而血清攻击后各组与空白组对照组比较, I-κBα/β-actinIOD比值显著减少,以攻击后1小时最明显;各时点EPO预处理组后血清攻击组与血清攻击组相比,I-κBα/β-actinIOD比值显著增加。结论: EPO具有减轻窒息后血清所致HK-2细胞损伤的作用,EPO预处理通过预激活NF-κB,而抑制窒息后血清所致后续NF-κB进一步激活。目的:研究黄芪注射液对新生儿窒息后血清诱导人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的保护作用及机制。方法:(1)以HK-2为研究对象。(2)以窒息后第一天20%(体积分数)血清作为攻击因素。(3)第一阶段实验共分为对照组、窒息组和黄芪干预组,黄芪干预组设立5个浓度亚组,探讨黄芪是否具有保护作用及最适保护浓度。(4)第二阶段实验以最适保护浓度预处理细胞,攻击前分为空白对照组和黄芪预处理组,在攻击后15min,1h,2h分为相应时间的血清攻击组和黄芪预处理组后攻击组。(5)检测指标:第一阶段实验在倒置相差显微镜下观察细胞的形态学改变,生化法检测培养上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率和MTT法检测细胞活力的变化;第二阶段实验通过激光共聚焦显微镜观察间接免疫荧光染色后NF-κB核转位以及免疫印记(Western blot)观测NF-κB抑制亚基I-κBα量的变化。(6)统计学处理:所有数值以均数±标准差(x±S)表示,实验组各时间点进行单因素方差分析,组间进行LSD检验。P<0.05为差异有显著性。采用SPSS12.0统计软件完成。结果:(1)倒置相差显微镜下观察HK-2细胞生长状况:对照组细胞贴壁良好,透明度大,折光性强,呈扁平的多角形,分裂相多,细胞排列紧密,连接成片,数量多。窒息组细胞生长缓慢,细胞数量比对照组明显减少,细胞形态发生改变,由典型的扁平多角形细胞变为不规则圆形或椭圆形,折光性减弱,轮廓增强,胞质中常出现空泡,脂滴,颗粒样物质,细胞间空隙加大,连接松散,细胞间可见较多细胞碎片。黄芪组:黄芪组随浓度的增加,细胞损伤明显得到改善,其保护效果在浓度>20ug/ml上时较明显,40ug/ml时保护效果最强。(2)与对照组相比(63.50±1.30%),模型组LDH漏出率明显增加(76.37±1.32%),各浓度黄芪与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。黄芪组各组LDH漏出率均低于模型组,高于对照组,在5ug/ml-40ug/ml范围内保护效应逐渐增加,40ug/ml时保护效果最强,LDH漏出率最小(65.29±1.34%),但是与对照组仍具统计学差异,而>40ug/ml时保护效应反而下降。(3)与对照组相比(0.642±0.018),模型组细胞活力(OD值)明显降低(0.240±0.036)。各浓度黄芪与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。黄芪组各组OD值均高于模型组,低于对照组,在5ug/ml-40ug/ml范围内保护效应逐渐增加,40ug/ml时保护效果最强,OD值最大(0.593±0.044),但是与对照组仍具统计学差异(P<0.05),而>40ug/ml时保护效应反而下降。(4)攻击前与空白对照组相比(9.7±1.2%),黄芪预处理组NF-κB核转位率无变化(10.0±2.0%);而血清攻击后各组与空白组对照组比较,NF-κB核转位率显著增加,以攻击后1h最明显(75.7±4.7%);各时点黄芪预处理组后血清攻击组与相应血清攻击组相比, NF-κB核转位显著减少。(5)攻击前与空白对照组相比(0.54±0.09),黄芪预处理组I-κBα/β-actinIOD比值无变化(0.54±0.10);而血清攻击后各组与空白组对照组比较, I-κBα/β-actinIOD比值显著减少,以攻击后1h最明显(0.02±0.01);各时点黄芪预处理组后血清攻击组与相应血清攻击组相比, I-κBα/β-actinIOD比值显著增加。结论:黄芪具有减轻窒息后血清所致HK-2细胞损伤的作用,黄芪预处理能够抑制窒息血清所致后续NF-κB激活。