目的:目前世界范围内,糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN))是导致终末期肾脏疾病的首要原因。尽管严格的血压和血糖控制能够有效减缓1型或2型糖尿病所致糖尿病肾病的疾病进程,但仍不能完全阻止糖尿病肾病的发生和发展,因此迫切需要针对糖尿病肾病的新的治疗策略和方法。肾脏的微炎症状态目前已成为糖尿病肾病发生发展的重要基础。炎性小体的活化已在多种肾脏固有细胞中被报道,并在糖尿病肾病中得到证实。细胞焦亡是一种由炎性caspase-1、caspase-4、caspase-5(鼠caspase-1、caspase-11)所介导的炎症性程序性细胞死亡,是机体对感染和细胞损伤的免疫应答。这种溶解性的细胞死亡因具有细胞溶解和胞质内容物释放的特征而与细胞凋亡不同。这是一种由gasdermin D(GSDMD)介导的细胞膜裂孔形成并导致细胞肿胀和破裂的细胞死亡过程。作为一种先天免疫反应,细胞焦亡曾被认为是免疫细胞所特有的病理生理过程。然而,肾脏固有细胞是否通过细胞焦亡促进糖尿病肾病的发生,又是否可以通过细胞焦亡调控DN的进展目前尚不清楚。VX-765是一种有效的生物可利用的无毒小分子抑制剂,口服VX-765对人类是安全的,已在一项为期6周的II期人体临床试验中进行了测试,用于治疗癫痫。因此,VX-765是一种安全、有效、可行的药物。近期,研究者报道了VX-765在心脏缺血再灌注损伤和神经系统疾病中的治疗作用,而VX-765在DN中的应用尚未见报道。既往研究指出caspase-1基因敲除可以在糖尿病小鼠中发挥肾脏保护作用。但caspase-1沉默是否通过调控细胞焦亡发挥其对DN的肾脏保护作用目前尚不清楚。本研究旨在探讨VX-765能否用于治疗糖尿病肾病,能否通过调控细胞焦亡改善DN肾脏损伤和预后。方法:1.为了研究细胞焦亡在糖尿病肾病肾小管上皮细胞中的作用,我们使用人肾近曲小管上皮细胞系(HK-2细胞)。分别以5.5mM、15mM、25mM、35mM D-葡萄糖和甘露醇为干预条件培养细胞48小时。采用蛋白质免疫印迹法(western blot)检测NLRC4、cleaved-caspase-1和细胞焦亡标志蛋白GSDMD p30片段表达情况,以了解不同浓度葡萄糖对HK-2细胞炎症信号通路活化水平的影响。为了明确HK-2细胞中caspase-1是否通过NLRC4介导的机制而活化,我们对高糖处理的细胞进行免疫共沉淀分析,并使用小干扰RNA(siRNA)敲减NLRC4,观察活性caspase-1p20片段表达变化。2.为了进一步明确高糖环境下HK-2细胞是否发生细胞焦亡,我们对高糖处理后的细胞进行FAM-YVAD-FMK和PI荧光染色,使用共聚焦显微镜结合免疫荧光染色观察细胞形态改变。并采用流式细胞术对25mM D-葡萄糖分别处理24和48小时,以及甘露醇处理48小时后的细胞,定量分析其发生焦亡(FAM-YVAD-FMK~+/PI~+细胞)比率。3.为了明确caspase-1是否在高糖诱导的细胞焦亡中发挥重要作用,我们使用了两种选择性caspase-1抑制剂VX-765和Z-YVAD-FMK来阻断caspase-1活性,采用western blot检测焦亡相关蛋白NLRC4、GSDMD和IL-1β,以及纤维化指标collagen I和fibronectin表达变化。同时应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中细胞分泌的IL-1β水平。然后应用流式细胞术或检测LDH活性来分析各组中焦亡细胞的比率。4.我们采用给小鼠腹腔注射STZ造模的方式,来获得糖尿病小鼠(DM)动物模型。为了解炎症和细胞焦亡在糖尿病肾病进程中的作用,应用western blot分析不同周龄糖尿病小鼠肾皮质NLRC4、caspase-1、GSDMD以及collagen I和fibronectin表达的动力学过程。检测分析血尿生化指标和肾脏病理改变。5.为了进一步明确VX-765能否作为DN的有效治疗方式。我们在STZ注射两周后开始给予DM小鼠每天腹腔注射100mg/kg VX-765治疗,连续8周。监测小鼠的体重和血糖,收集血清和尿液,检测血肌酐、尿素氮、血白蛋白和尿白蛋白/肌酐比值。Western blot分析各组小鼠肾皮质NLRC4、GSDMD、IL-1β、collagen I和fibronectin的表达变化。应用ELISA法检测肾皮质组织匀浆IL-1β水平。免疫组化/免疫荧光分析GSDMD、CD45、collagen I和fibronectin在肾组织中表达情况。HE及Masson染色分析各组小鼠肾脏病理改变。6.我们前期通过芯片分析筛选了一系列异常调节的circRNAs,这些circRNAs有可能通过调控焦亡来参与肾小管损伤。本研究中我们使用RT-qPCR验证了10个明显差异表达的circRNAs。采用质粒转染shRNA的方式,向高糖刺激的HK-2细胞转染circACTR2 shRNA。应用ELISA法检测细胞分泌的IL-1β水平。流式细胞术及LDH活性检测分析各组中焦亡细胞的比率。应用western blot检测collagen IV和fibronectin表达变化。结果:1.高糖刺激上调肾小管上皮细胞NLRC4表达水平,促进caspase-1和GSDMD的剪切活化。免疫共沉淀分析表明高糖刺激HK-2细胞NLRC4/caspase-1炎性小体组装,NLRC4敲减可显著抑制caspase-1活化。2.我们利用共聚焦显微镜定位到焦亡细胞(FAM-YVAD-FMK~+/PI~+细胞)并在透射光下观察其细胞形态,发现细胞呈气球样改变的细胞膜膨胀特征,即细胞焦亡形态改变。流式细胞分析结果表明高糖处理能显著增加细胞焦亡比率,并在处理48小时后更为明显,而甘露醇所致的渗透压改变并不是促进细胞焦亡的主要因素。3.Caspase-1抑制剂治疗可下调高糖中GSDMD p30、mature-IL-1β的高表达,并抑制细胞释放IL-1β。VX-765和Z-YVAD-FMK均可显著抑制高糖处理的HK-2细胞发生焦亡的比率和LDH的释放。高糖促进纤维化指标collagen I和fibronectin蛋白表达上调,而caspase-1抑制剂可显著下调其高表达。4.10周龄DM小鼠中NLRC4、caspase-1和GSDMD表达开始呈上调趋势,表明炎症和细胞焦亡在糖尿病肾病早期即参与疾病的发生发展。而collagen I和fibronectin在13或16周DM小鼠中开始高表达,提示炎症和焦亡发生早于纤维化发生,并可能是介导肾脏纤维化的原因。病理分析显示16-18周龄DM小鼠肾脏发生明显细胞外基质聚集和小管间质纤维化。5.VX-765治疗可显著减少糖尿病小鼠的蛋白尿,有效改善小鼠的肾功能,降低肾皮质中GSDMD p30、mature-IL-1β、collagen I和fibronectin的高表达。免疫组化染色显示在DM中,GSDMD高表达于肾小管上皮细胞,中度表达于足细胞,VX-765治疗可下调其表达。免疫组化/免疫荧光染色分析显示VX-765治疗可抑制DM肾脏中CD45~+的炎性细胞浸润,下调collagen I和fibronectin在肾组织中的高表达。HE、Masson染色分析显示DM肾脏的肾小管损伤和间质纤维化在VX-765治疗后得到缓解。其治疗作用亦不依赖于体重和血糖改变。6.在候选的circRNAs中,我们发现circACTR2在高糖处理的HK-2细胞中显著上调,而VX-765治疗可以抑制其高表达。敲减circACTR2能够显著降低细胞焦亡、IL-1β分泌、胞质内容物释放和细胞外基质蛋白产生,提示circACTR2能有效调控细胞焦亡和炎症。结论:1.糖尿病状态下肾小管上皮细胞发生细胞焦亡,表现为气球样细胞膜膨胀、caspase-1活化、GSDMD剪切、促炎细胞因子释放和胞质内容物渗出,NLRC4炎性小体参与高糖环境下肾小管上皮细胞中caspase-1介导的炎症信号通路活化。2.VX-765可有效抑制caspase-1酶活性、GSDMD剪切、IL-1β成熟和释放、胞质内容物LDH释放并减少焦亡细胞比率,有效改善糖尿病小鼠蛋白尿、肾功能,下调炎症指标的表达,减轻肾间质纤维化。3.VX-765通过下调高糖状态下circACTR2的异常高表达,显著降低肾小管上皮细胞焦亡、IL-1β分泌和胞质内容物释放,发挥肾脏保护作用。