目的蛋白质组学的研究包括前期的样本提取与纯化；中期的蛋白质分离与分析鉴定；后期的数据处理与分析。蛋白质鉴定与基因测序相比,最主要的困难是蛋白质的结构及组成远比基因复杂,而且蛋白质组是动态变化的,所以蛋白质的质谱鉴定技术高通量的限制因素之一就是蛋白质的分离技术。传统的蛋白质组学研究策略是基于二维电泳-质谱技术(2-DE-MS),二维电泳分离能力有限,而液相色谱(LC)弥补了双向凝胶电泳的缺陷,由此我们需要探索新型适用于复杂生物样品中蛋白质酶解及分离技术,来提高蛋白质的质谱鉴定水平。肿瘤性疾病从蛋白质组学角度又被认为是一种蛋白质缺陷病,在其发生发展的不同阶段,即使在没有任何症状的早期或癌前病变期,在血清中蛋白质水平上往往就已经发生了变化。将新型的蛋白质组学技术和整合方式,应用于临床肿瘤性疾病的诊断,验证其在复杂体液蛋白质组学研究中具有一定的可行性。方法1、用promega和自主修饰Self-owned胰蛋白酶酶解不同浓度的牛血清白蛋白(bull serum albumin, BSA)测定其总离子流图(TIC)并利用Proteome Discoverer软件进行数据处理,测定BSA的覆盖率。2、用自主修饰Self-owned胰蛋白酶酶解BSA,将酶切液用本研究制备的二维一体毛细管色谱柱进行分离,应用高效液相色谱与质谱(nanoHPLC-MS)技术平台,通过TIC、保留时间(retention time,RT)和信号强度,考察其毛细管色谱柱分离性能及重复性。3、选取2012年3月至2013年6月在天津市第三中心医院进行体检的30例健康人、和肝胆外科进行治疗的20例HBV相关性肝炎患者、20例HBV相关性肝硬化患者和20例肝细胞肝癌术前患者的血清,其中血清为纳入标准的患者入院伊始未经过任何治疗的早上空腹血清样本,借助nanoHPLC-MS技术对蛋白质进行前期处理与分析鉴定,将处理所得数据在利用OMSSA软件进行分析,鉴定蛋白质数量,为后续筛选潜在蛋白标志物做准备。结果1、用promega和自主修饰Self-owned胰蛋白酶酶解不同浓度的BSA,即在完全相同的实验条件下,自主修饰Self-owned胰蛋白酶在nanoHPLC-MS技术鉴定高、中、低浓度BSA的覆盖率为38.22%、28.34%、13.18%；而用promega胰蛋白酶酶解BSA的覆盖率为34.93%、26.36%、10.21%。2、用自主修饰Self-owned胰蛋白酶和本研究制备的二维一体毛细管色谱柱联用,应用于BSA的分析,通过LTQ-Orbitrap XL质谱进行分析,其在极低浓度条件下,鉴定BSA的覆盖率为24.22%。3、在完全相同的实验条件下做两次,观察本研究所制备的二维一体毛细管色谱柱的重复性,选取BSA酶切的肽段混合物中相应强度较高的质荷比(m/z)740.4为特征肽段,两次的RT分别是51.90min、51.95min及信号强度分别是6.77×105、7.42×105。4、通过对蛋白质组学技术改进和整合,利用自主修饰Self-owned胰蛋白酶对血清中提取的蛋白质进行酶解,借助nanoHPLC-MS技术平台,采用强阳离子交换与反相C18二维一体毛细管色谱柱进行分离和LTQ Orbitrap XL质谱的蛋白准确定量,再利用OMSSA软件的强大数据处理功能对蛋白质进行分析,最终鉴定出3578种蛋白。结论通过对鉴定BSA理化性能的统计分析,实验结果表明自主修饰Self-owned胰蛋白酶具有高催化活性,我们所制备的二维一体毛细管色谱柱具有较好的分离性能和重复性。本研究将这种技术改进和整合方式应用于人血清样本中,经过Self-owned胰蛋白酶酶解、二维一体毛细管色谱柱分离、LTQ Orbitrap XL质谱的蛋白准确定量,再通过OMSSA软件对前期所得数据进行分析,最终鉴定出3578种蛋白。此鉴定的蛋白数足以支持其后期的数据处理,筛选具有潜在表达差异的蛋白标志物。为后续寻找肝脏肿瘤发生发展过程中具有早期诊断、监测价值的蛋白标志物打好基础。由此可推断此种方法在蛋白质组学研究中具有一定的可行性,可以在液-质联用系统中用于复杂体液、细胞或组织等复杂蛋白质组表达谱的构建。