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脑缺血再灌注损伤能够引起神经细胞损伤,导致细胞凋亡或坏死,引起缺血区脑组织神经功能失调。自噬是细胞内的各种基质和细胞器通过溶酶体系统降解的过程,它是促进细胞在各种压力环境下存活的重要功能。线粒体既是细胞内能量供应的主要细胞器,也是活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生的主要来源,同时也是细胞缺氧再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤的重要作用靶点。I/R损伤导致细胞内ROS含量增加,细胞器受损并导致线粒体功能障碍,受损的线粒体最终通过线粒体自噬途径被选择性的清除。因此,线粒体自噬在线粒体质量控制和细胞存活中具有重要的作用,及时清除受损伤的线粒体对细胞对抗I/R损伤具有重要的意义。大量研究证明,线粒体自噬功能受损或过度激活均与细胞死亡有关。通过线粒体自噬途径及时清除受损伤的线粒体对神经细胞的存活是有益的,而过度激活的自噬往往会清除细胞内大量的重要细胞器,如线粒体,造成细胞损伤,并最终导致细胞发生自噬性死亡。线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)是线粒体钙离子转运的重要通道,而钙离子对线粒体自噬具有重要的调控作用。在纯化的线粒体体外实验中已经证明,MCU能够调控线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)的开放,而MPTP在诱导线粒体自噬方面具有重要的调控作用。另一方面,线粒体是一个动态的细胞器,不断的进行着分裂和融合活动。线粒体分裂能够产生两个不同代谢水平的子线粒体,具有正常膜电位的健康线粒体能够继续参与线粒体的分裂和融合活动,而膜电位较低的子线粒体往往通过线粒体自噬途径而降解、清除,因此,线粒体分裂会促进线粒体自噬的发生,可能是线粒体自噬所必需的上游事件。有趣的是,MCU能够调控线粒体的分裂和融合,通过抑制线粒体分裂或促进线粒体融合能够抑制线粒体自噬的发生。抑制线粒体分裂,能够降低海马神经元中ROS的含量,下调线粒体分裂蛋白Drp1、细胞色素C(cytochrome,Cyt C)和促凋亡蛋白Bax的表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达并提高Bcl-2/Bax蛋白比值,通过减少细胞凋亡途径而减轻海马神经元缺氧复氧损伤。由于凋亡和自噬之间存在着复杂的联系,尽管MCU对细胞自噬和线粒体自噬的调节作用仍不确切,我们猜测MCU与细胞自噬和线粒体自噬之间也存在着紧密的联系,并且能够决定神经细胞的最终命运。目的:研究I/R损伤对神经细胞自噬和线粒体自噬水平的影响,探讨MCU对I/R损伤诱导的细胞自噬和线粒体自噬的调控作用。方法:通过建立神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的氧糖剥夺再灌注(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/RP)损伤细胞模型来模拟脑I/R损伤。实验细胞随机分为6组:(1)正常对照组:细胞在正常条件下培养未经任何处理;(2)OGD/RP组:细胞经过OGD处理6小时后,恢复正常培养条件继续孵育24小时;(3)OGD/RP+RU360组:细胞在OGD前加入Ruthenium 360(RU360)(10μm)共同孵育30分钟,OGD后恢复正常培养条件继续孵育24小时;(4)OGD/RP+Sper组:细胞在OGD前加入精胺(Sper)(10μm)孵育30分钟,OGD后恢复正常培养条件继续孵育24小时;(5)RU360组:细胞与RU360(10μm)共同孵育30分钟,然后恢复正常培养条件继续孵育24小时;(6)Sper组::细胞与Sper(10μm)共同孵育30分钟,然后恢复正常培养条件继续孵育24小时。采用cell counting kit-8试剂盒(CCK-8)法检测各组细胞的活性,JC-1线粒体膜电位试剂盒检测各组细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potentia,MMP),透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)检测各组细胞的超显微结构,Western blot法检测各组细胞线粒体自噬相关蛋白P62、Tom20、Beclin-1的表达水平。数据采用SPSS 18.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,p<0.05为差异有统计学意义。结果:细胞活性检测结果显示:与对照组比较,OGD/RP组、OGD/RP+RU360组和OGD/RP+Sper组细胞活性明显下降(p﹤0.001);与OGD/RP组比较,OGD/RP+RU360组细胞活性明显升高(p﹤0.001),OGD/RP+Sper组无显著性差异(p﹥0.05);RU360组和Sper组细胞活性与对照组比较结果无显著性差异(p﹥0.05)。TEM检测结果显示:OGD/RP组、OGD/RP+RU360组和OGD/RP+Sper组细胞内线粒体明显肿胀,能够检测到典型的自噬体或线粒体自噬溶酶体结构,线粒体数量较对照组明显减少;与OGD/RP组比较,OGD/RP+RU360组线粒体肿胀明显减轻,线粒体形态较完整;RU360组和Sper组细胞线粒体形态较对照组无明显差异。MMP检测结果显示:与对照组比较,OGD/RP组、OGD/RP+RU360组和OGD/RP+Sper组MMP明显降低(p﹤0.001);与OGD/RP组比较,OGD/RP+RU360组MMP明显升高(p﹤0.001),OGD/RP+Sper组无显著性差异(p﹥0.05);RU360组和Sper组MMP与对照组比较结果无显著性差异(p﹥0.05)。蛋白印迹结果显示:与对照组比较,OGD/RP组、OGD/RP+RU360组和OGD/RP+Sper组P62、Tom20表达水平明显下降,Beclin-1表达水平明显增高(p﹤0.001);与OGD/RP组比较,OGD/RP+RU360组P62、Tom20表达水平明显增高,Beclin-1表达水平明显下降(p﹤0.001),OGD/RP+Sper组各蛋白表达水平无明显变化;RU360组和Sper组各蛋白表达水平较对照组无明显变化。结论:1、OGD/RP损伤诱导了SH-SY5Y细胞自噬和线粒体自噬的发生。2、MCU能够调节OGD/RP损伤诱导的SH-SY5Y细胞的自噬与线粒体自噬水平。3、抑制MCU能通过保护细胞的形态和功能,维持正常的线粒体膜电位,降低OGD/RP损伤诱导的自噬与线粒体自噬水平,保护SH-SY5Y细胞减轻OGD/RP导致的细胞损伤。