Pseudomonas stutzeri XL-2的成膜机制及其在序批式生物膜反应器中的强化应用

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序批式生物膜反应器(Sequencing Batch Biobiofilm Reactor,SBBR)是利用生物膜载体能够降解污染物的原理开发的复合式生物反应器,具有抗冲击负荷、运行状况稳定、节能高效、无污泥膨胀、同步脱氮等优点。然而,生物膜的形成过程往往较为缓慢,这制约着SBBR工艺的应用前景。现有研究表明,生物膜形成菌由于具有大量分泌胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)的特性,在生物膜形成过程中起着重要作用。深入研究生物膜形成菌的成膜机制,可为SBBR的快速启动并保持高效污水处理能力提供方法参考。论文以一株具有成膜能力的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)XL-2为研究对象,通过表面热力学分析、扩展DLVO理论计算、红外光谱(FT-IR)、三维荧光光谱(3D-EEM)、激光共聚焦显微镜(CLSM)、XPS等方法,考察EPS在菌株XL-2生物膜形成中的作用;通过基因组测序、功能基因注释及信号分子检测等方法,探讨EPS生物合成相关基因及信号分子对EPS的调控作用;进一步地,利用菌株XL-2对聚丙烯载体进行预处理后投加到SBBR中,考察菌株XL-2对反应器挂膜效果的强化作用并探讨其强化机制。研究成果为深入了解生物膜形成菌的成膜机制及其在生物膜反应器中的应用提供理论参考。论文所取得的结论如下:对P.stutzeri XL-2生物膜形成中EPS的组分及作用进行研究,研究结果表明:(1)P.stutzeri XL-2具有生物膜形成能力和EPS合成能力,EPS可能对成膜产生影响。蛋白质和TB-EPS(Tightly Bound EPS)分别是EPS中的主要组分和主要构成。从分布来看,胞外蛋白的分布更均匀且与细胞表面结合更紧密,多糖的分布则较为分散。(2)蛋白质与成膜量存在显著线性相关性,酶解EPS中的蛋白也使成膜量从2.13降低到1.57,蛋白质是影响成膜的主要因素。去除TB-EPS使聚集成膜能力从60.6%降低到44%,回加后又恢复为50.8%,去除S-EPS和LB-EPS后成膜能力分别降低至52.8%和57.5%。TB-EPS中蛋白质和多糖对聚集成膜的贡献率分别为69.2%和29.0%。因此,TB-EPS的蛋白可能是影响P.stutzeri XL-2生物膜形成的重要因素。(3)根据扩展DLVO理论,EPS能影响生物膜形成是因为将酸碱相互作用转变为吸引力,表现为细菌表面更加疏水。疏水性在TB-EPS中的体现是包含更多疏水性基团,在蛋白质中的体现是含有更多疏水性氨基酸。除此之外,TB-EPS还具有更多促进微生物聚集的蛋白质二级结构。对EPS的生物合成相关基因及其信号调控进行研究,研究结果表明:(1)P.stutzeri XL-2的基因组包含43条基因组(scaffold)和4499条参考序列(ungiene)。使用GO注释获得16009个功能注释,其中与EPS合成可能有关的注释共11类。使用KEGG注释鉴定了P.stutzeri XL-2的代谢通路,最大的20个带注释的二级通路组中关于合成蛋白质的二级代谢通路比合成多糖的更多。在P.stutzeri XL-2注释基因组中找到83条EPS生物合成基因。(2)P.stutzeri XL-2能产生AHLs和AI-2。P.stutzeri XL-2产生C6-HLS、C6-oxo-HLS、C8-HLS的最高浓度分别为0.63μg/L、0.45μg/L和0.05μg/L。C6-HLS、C6-oxo-HLS的浓度与EPS蛋白和TB-EPS蛋白的含量都具有显著相关性,但与EPS和多糖没有相关性。通过外源添加发现一定浓度阈值的C6-HLS、C6-oxo-HLS可以刺激P.stutzeri XL-2产生TB-EPS蛋白质,且P.stutzeri XL-2对C6-oxo-HLS更敏感。对P.stutzeri XL-2在SBBR中的强化应用进行研究,结果表明:(1)利用P.stutzeri XL-2在聚丙烯载体上挂膜制备P.stutzeri XL-2改良生物载体,在相同条件下制备活性污泥改良生物载体。P.stutzeri XL-2在载体上的生物膜重量、生物膜厚度和产生的EPS都比活性污泥多。(2)将P.stutzeri XL-2改良生物载体和活性污泥改良生物载体分别投加到SBBR1和SBBR2内,结果发现SBBR1的载体挂膜在第33天基本完成,SBBR2直到第42天才基本完成挂膜。污染物的去除率随生物膜量的增加而提高,由于SBBR1先完成挂膜,所以其水质先稳定。整个挂膜过程中,SBBR1中载体上的生物膜重量和生物膜厚度始终大于SBBR2,同时SBBR1的生物膜产生的EPS含量也比SBBR2高。这说明P.stutzeri XL-2改良生物载体能够加速SBBR的挂膜过程,使反应器能更快速地启动。(3)冲刷实验中发现,P.stutzeri XL-2在载体表面的附着能力比活性污泥更好。而附着实验中发现,P.stutzeri XL-2生物膜较活性污泥生物膜能够粘附更多的活性污泥微生物,表明P.stutzeri XL-2改良生物载体能够通过提高对污泥的粘附来强化挂膜。P.stutzeri XL-2良好的附着能力可能与其分泌大量的EPS有关。SBBR1中P.stutzeri XL-2的相对丰度为6.7%,而SBBR2未检出,证明P.stutzeri XL-2能在反应器内存活并生长为优势菌属以促进生物膜形成。此外,SBBR1中自身成膜或产生EPS的细菌相对丰度之和为45.1%,高于SBBR2,说明P.stutzeri XL-2所产生的EPS还可以吸引有利于成膜的微生物附着,加快SBBR生物膜形成。
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