家蚕是继果蝇和按蚊之后的又一个全基因组测序的昆虫,是一种重要的经济和模式生物。中国的蚕茧、蚕丝产量均居世界首位,但是在蚕业生产上总是遇到一种传染病的影响,每年造成巨大损失,该病由家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)感染。本课题组前期对我国344个家蚕品种资源进行了抗病鉴定,发现了一个高抗BmNPV的地方种,其半致死剂量是感病品系家蚕的1000倍以上。经过10多年的培育筛选到一个高抗品系NB,再利用杂交和回交的方法,构建了感病品系306的近等基因系BC8。遗传分析表明NB对BmNPV的抗性表现出显性单基因控制的遗传规律。利用高抗品系NB,通过第二代高通量测序技术筛选了与抗性基因相关的多态性分子标记,并利用遗传群体对多态性分子标记与抗性基因的连锁性进行了分析,将抗性基因定位于家蚕第23号染色体上一段区域。对该区域潜在的22个基因进行序列分析,发现了一种羧酸酯酶基因—α-酯酶-42(α-esterases42),与感性品种家蚕相比在抗性品系家蚕中出现了突变。羧酸酯酶(Carboxylesterases)属于多功能超家族,广泛存在动物,植物,昆虫和微生物当中,具有催化水解含酯类化合物的功能。它在信息素降解,外源化合物解毒,脂类物质转运,神经发生及发育调控等方面起到至关重要的作用。昆虫羧酸酯依据底物特异性和序列相似性分为8个亚族:α-esterase(α-酯酶),β-esterase(β-酯酶),乙酰胆碱酯酶,保幼激素酯酶,Neurotactins(神经趋化蛋白),Neuroligins(神经连接蛋白),Glutactin和Gliotactin。在以往的研究中,将果蝇和按蚊作为模式生物,对于羧酸酯酶的研究主要集中在其对杀虫剂的抗性功能。近期有文献报道,人的羧酸酯酶1(CES1)是丙型肝炎病毒复制过程中十分重要的宿主酶,暗示羧酸酯酶可能存在对病毒的抗性功能。因此,本文以家蚕羧酸酯酶Bmae42基因为研究对象,利用多种分子生物学手段对其进行分析,为阐明Bmae42基因对BmNPV抗性功能奠定基础,主要结果研究如下:(1)利用生物信息学对Bmae42基因进行分析,发现家蚕羧酸酯酶Bmae42与其它物种羧酸酯酶都存在特有的三联体催化中心Gly-X-Ser-X-Gly。(2)通过克隆得到了感病品系家蚕306,抗病品系家蚕NB和BC8的羧酸酯酶Bmae42全长基因,将不同品种羧酸酯酶Bmae42基因对比,发现在抗病品系家蚕中该基因发生了五个位点的突变。其中两个位点为糖基化位点,可能与抗性功能相关。(3)荧光定量PCR分析结果显示:五龄家蚕Bmae42基因的转录水平最高,暗示其在五龄阶段的活性最高。另外在脂肪体和中肠中检测到较高转录水平。(4)构建His标签的Bmae42重组表达质粒,对其进行原核诱导表达,获得可溶性蛋白;对纯化得到的蛋白进行活性分析,比较不同品种家蚕羧酸酯酶Bmae42的活性差异;同时将重组蛋白用于免疫小鼠,获得多克隆抗体,为后续蛋白研究提供基础。(5)转录时相分析结果显示:Bmae42可在抗BmNPV品种NB和BC8中被病毒激活。推测,Bmae42基因表达上调是抗性品系NB和BC8对BmNPV的病毒感染的一种免疫应答反应。(6)构建抗性品种家蚕中的Bmae42瞬时表达质粒,探究其对病毒增殖影响。上述研究结果表明:家蚕羧酸酯酶Bmae42是一种水解蛋白酶,不同品种家蚕的Bmae42活性差异并不明显,但是与BmNPV病毒的入侵和增殖密切相关。