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赭曲霉毒素（Ochratoxin）是由曲霉菌属（Aspergillus）和青霉菌属（Penicillium）的某些种产生的次级代谢产物,包含7种结构类似的化合物。其中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）毒性最强,具有肾脏毒性、肝脏毒性及致畸、致癌和致突变等特性。纳米抗体（Nanobody,Nb）又被称为单域重链抗体（Variable domain of heavy chain antibody,VHH）,由天然缺失轻链的重链可变区构成,是自然存在的可与抗原结合的最小片段,具有分子质量小、易改造、易于表达以及稳定性好等优点。随着科学技术的发展与研究的深入,结合基因工程技术经过改造携带特定结构的纳米抗体具有更加明显的优势,如多价纳米抗体、融合型纳米抗体、多特异性纳米抗体等均具有未改造前纳米抗体所没有的特性,为建立更加灵敏的检测方法提供了基础。免疫亲和柱技术是通过存在于生物体抗原和抗体之间的高度特异性和亲和力,来达到分离纯化的一种方法。与其他提取方法比较,免疫亲和柱技术具有有毒试剂使用少、方便简洁、有效排除基质干扰等优点。本研究基于原核表达载体pET-CTB-VHH28,将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达,得到纯度较高的五价纳米抗体,并利用表达纯化后的CTB-VHH28制备赭曲霉毒素A免疫亲和柱,主要研究结果如下:1.纳米抗体CTB-VHH28表达及活性分析利用原核表达载体pET-CTB-VHH28将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达成功表达出五价纳米抗体,通过对其表达条件的优化,确定了最佳表达条件为:表达温度16℃、诱导剂浓度0.05 mmol/L、诱导时间12 h。经Ni柱纯化后得到了纯度较高的五价纳米抗体,表达量可达20 mg/L。基于CTB-VHH28绘制间接竞争ELISA标准曲线,其IC50为0.38 ng/mL。通过对其热稳定分析,当CTB-VHH28在70℃进行加热处理时,五聚体结构开始被破坏。当加热温度高于85℃时,抗体基本失活,CTB-VHH28失活的临界温度在5575℃之间。对其甲醇耐受性分析,当反应体系中甲醇浓度不高于10%时,抗原与CTB-VHH28的结合能力没有明显变化。有利于提高基于该纳米抗体所建立的检测方法的重复性和稳定性。2.基于纳米抗体CTB-VHH28免疫亲和柱制备通过将CTB-VHH28与溴化氰活化的琼脂糖微球在偶联缓冲液中进行随机偶联,成功制备出赭曲霉毒素A纳米抗体免疫亲和柱,确定了配体CTB-VHH28最佳偶联时间为3 h。制备的免疫亲和柱最佳上样缓冲液为10%-甲醇PBS缓冲液,pH=7.2,离子强度为0.1 mol/L。确定了洗脱液为90%甲醇溶液,洗脱体积为4 m L。对其性能进行评价,连续使用4次,回收率仍能达75%,37℃储存20天,回收率能达80%。对谷物样品进行加标回收实验,采用间接竞争ELISA对使用亲和柱净化的提取液进行测定,本研究中所制备的免疫亲和柱净化提取OTA标准品的回收率为84.3%106.6%,批间变异系数为1.34%9.37%,将其与商业化的OTA免疫亲和柱对比,其性能相当。