作为Ⅰ-型跨膜受体Toll样受体(Toll-like-reception,TLRs),是天然免疫中最重要的模式识别受体(pathogen recognition receptor,PRR)。作为最古老的受体家族之一,TLRs广泛存在于昆虫和脊椎动物中。昆虫中的Toll除了参与先天免疫还参与控制早期果蝇胚胎背腹轴的发育,无论是哪条途径,Toll都是通过胞外识别因子和蛋白酶级联系统激活sp?tzle配体起作用。而在哺乳动物中,TLR能作为模式识别受体PRR直接识别特定的病原物相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)。通过对TLR结构的分析发现,脊椎动物和昆虫之间确实存在着不同,那么TLR的祖先功能到底是什么?其在免疫上的关键受体作用是在昆虫和脊椎动物分化之前就存在,还是分化之后的趋同进化?这成为一个有争议的热点问题。基于以上问题,本研究以家蚕为模式生物,进行了以下内容的研究:(1)通过生物信息学分析了哺乳动物、昆虫等的TLR在进化上的关系。(2)以家蚕BmToll9为靶标,BLAST分析家蚕基因组中是否存在与哺乳动物TLR4配体MD2功能类似的ML家族蛋白。(3)通过ELISA实验研究家蚕ML家族蛋白与不同微生物组分的结合特性。(4)通过免疫共沉淀技术检测家蚕Bm Toll9是否能够与配体ML家族蛋白识别结合。(5)在家蚕Bm12细胞中超表达BmToll9,LPS诱导后检测是否能引起下游抗菌肽的表达。本论文获得了以下结果:(1)通过对哺乳动物、昆虫等TLR的进化树分析发现,哺乳动物和昆虫的TLR分属两个不同的分支,只有Toll9是个例外。BmToll9的结构与哺乳动物TLR4受体结构极为相似,都含有745个氨基酸,具有典型的跨膜结构域,其中1-550位氨基酸为胞外区域LRRs,同时在其末端C-端侧翼有一个保守的Cys基序。(2)对家蚕基因组数据库进行BLAST搜索,寻找到了三条ML蛋白质序列:Bm PP,BmEsr16和BmML-1。通过RT-PCR扩增获得了这3条基因序列,克隆至原核表达载体上,转化E.coli,经纯化获得BmPP、Bm Esr16和BmML-1重组蛋白质。通过ELISA检测发现,BmEsr16和BmML-1与不同的微生物组分都有结合特性。推测家蚕中的Bm MLs可能参与了与细菌PAMP的识别。(3)构建重组载体pIEX-4-Toll9-exto(BmToll9的胞外区部分),pIEX-4-BmML-1,pIEX-4-BmPP,pIEX-4-BmEsr16,转染果蝇S2细胞,通过BT抗生素筛选出稳定表达外源蛋白的细胞系。(4)通过免疫共沉淀发现,BmToll9蛋白与BmPP和BmEsr16蛋白均可以结合。暗示家蚕BmToll9与哺乳动物中TLR4蛋白功能类似,可以与MLs家族蛋白结合。(5)克隆BmToll9基因的全长序列,构建到含有eGFP荧光标签的表达载体pIEX-4-eGFP中,转染家蚕Bm12细胞,共聚焦显微镜检测发现BmToll9成功表达。加入BmEsr16和LPS诱导后,QRT-PCR检测发现抗菌肽基因Bm Moricin、BmAttacin转录表达活性显著上调,说明BmToll9可以在配体BmEsr16的帮助下,响应LPS诱导引发下游的先天免疫通路。