致病性大肠杆菌对人类食品安全和公共卫生具有严重威胁。大肠杆菌具有细菌趋化性,这是其能够致病的必要因素之一。尽管大肠杆菌能够利用趋化性受体阵列来精确的追踪环境中化学物质的浓度变化并对此做出适当的运动反应,但是,受体列阵间的相互作用机制尚不清楚,对于核心受体单元如何调节组氨酸自激酶Che A的活性方面知之甚少。为了进一步探索丝氨酸受体尖端结构对Che A激酶活性的控制机制,本论文在Tsr受体E385-R388盐桥残基对处,分别将这两个位点替换成其余的19个天然氨基酸,研究了氨基酸取代后对受体信号传导的影响。实验结果有助于我们更好的了解大肠杆菌是如何将自身趋化性与致病因素相关联,又是如何通过化学信号传导“趋利避害”的。主要研究结果如下:1、Tsr-E385*和Tsr-R388*所有氨基酸替换突变株的表型检测以p PA114质粒为模板,构建了Tsr-E385*所有氨基酸替换突变株。趋化性表型的结果表明,其中12个Tsr-E385*突变株能够对丝氨酸引诱剂做出反应,另外7个突变株在软琼脂平板上表现出丧失趋化性。所有的突变株均能够正常表达Tsr蛋白,说明突变株引起的趋化性缺陷并不是由于Tsr蛋白表达异常或不稳定所致。利用相同的构建方法,以p RR53质粒作为模板构建了Tsr-R388*的突变株。所有Tsr-R388*突变株均能够表达正常水平的Tsr受体蛋白,但是大部分突变株表现出趋化性功能缺陷。Tsr-R388*突变株受体对三聚体的形成不产生任何影响。因此,E385和R388之间的盐桥对于受体三聚体形成的稳定性不发挥重要作用。2、Tsr-E385*和Tsr-R388*突变株受体的胞内信号传导特点利用FRET方法对突变株进行信号传导检测,在无感觉适应性酶的UU2567宿主中,野生型Tsr分子具有QEQE的分子状态,拥有中等水平的激酶活性和丝氨酸敏感性。而在UU2700宿主中,由于具有适应性修饰酶的反馈修饰作用,野生型的Tsr分子能够表现出更多的OFF-偏移信号输出特点。大多数的突变株受体在不同的宿主中表现出了不同的激酶活性和丝氨酸反应行为,这说明突变株受体能够受部分感觉适应性系统调控。在具有单个感觉适应性酶的宿主中,具有OFF-偏移特性的受体更容易被Che R修饰,具有ON-偏移特性的受体更容易被Che B修饰。根据信号传导特点和对感觉适应性酶的底物特异性,Tsr-E385*和Tsr-R388*突变株受体被化分成了两大类:一类是由于丝氨酸反应的阈值变化产生的“OFF-偏移”和“ON-偏移”突变株,可以代表自然状态下“激酶-激活”和“激酶-抑制”尖端构象之间的平衡转换;另外一类突变株受体在尖端结构或稳定性方面具有更剧烈的变化,能够导致信号传导异常或者无法控制进而产生的“不良控制”和“无反应”现象。3、具有“OFF-偏移”或者“ON-偏移”特性突变株受体Tsr-E385A、V、T和Tsr-R388A、V、T、M、F突变株受体均表现出OFF-偏移特性激酶活性阈值降低,容易被Che R修饰。Tsr-E385S、Q和Tsr-R388G、W突变株受体表现出ON-偏移特性,具有完整的激酶活性,激酶活性阈值升高,具有与野生株接近的Che R和Che B的底物修饰性。产生信号输出偏移特性的Tsr-E385*和Tsr-R388*突变株在受体信号传导方面也具有几点不同。在缺乏感觉适应性系统的宿主中,具有OFF-偏移特性的突变株受体间协同性都明显降低。然而,具有ON-偏移特性的Tsr-E385S、Q突变株与具有OFF-偏移特性的突变株受体一样,受体间协同性降低。但是,同样是具有ON-偏移特性的Tsr-R388G、W突变株受体间的协同性却与野生型接近。在含有完整感觉适应性系统的宿主中,具有偏移特性的Tsr-E385*突变株能够表现出明显的适应性,如Tsr-E385A、S、V、T、Q。而Tsr-R388*突变株在相同的宿主中却没有表现出明显的适应性,如Tsr-R388A、G、T、W。以上两组突变株受体在R⁺B⁺宿主中都表现出了类似于野生型的激酶活性,这表明尽管突变株比野生株反应迟缓,但是依旧能够调控信号的输出。在所有的Tsr-R388*突变株中,只有Tsr-R388K表现出了同野生株相类似的修饰适应性行为。Tsr-R388V、M、F表现出更加明显的OFF-偏移特性,这类突变株能够在R^-B^-宿主中产生一部分激酶活性,并且在丝氨酸刺激结束后不能恢复其活性至初始水平。引诱剂和感觉适应性系统不仅影响野生型受体的激酶活性,也调节着受体列阵中的信号传导团队的大小。在UU2869宿主（具有不能在核心单元之间形成阵列接口2连接的Che W-X3突变体）中检测了Tsr-R388V、M、F突变株受体的信号传导特性。野生型的Tsr受体在UU2869中具有正常的激酶活性,表现出对丝氨酸的反应敏感度升高、受体间的协同性降低等特点,这些特征都是非网络化信号传导的标志。然而,Tsr-R388V、M、F在UU2869中却丧失了激酶活性。因此,这些突变株的侧链使受体激酶-激活的状态变得不稳定,或者在丝氨酸刺激后,经过感觉适应性系统的修饰,将受体限制在激酶-抑制的状态。4、对输出信号控制较差的突变株受体在缺乏感觉适应酶宿主中,Tsr-E385N和G突变株受体表现出对丝氨酸刺激反应迟缓,受体间的协同性降低,移除丝氨酸后激酶活性的恢复也较慢。Tsr-E385F、Y、W、H在该宿主中,不具有受体间协同性,仅具有部分可控的激酶活性。在R^-B^-宿主中,用接近K_1/2丝氨酸浓度刺激突变株受体可引起激酶活性的迅速下调,随后可以看到下一次刺激前激酶活性的快速恢复。然而,在R⁺B⁺的宿主中,Tsr-E385Y和W没有表现出适应性行为,这表明QEQE的修饰状态对突变株的激酶活性恢复过程十分重要。在UU2869宿主中,Tsr-E385Y突变株能够完全调控激酶活性,但不会产生类似适应性的修饰行为,Tsr-E385W突变株则完全相反,完全丧失对激酶活性的控制。因此,核心受体复合物之间的网络连接不仅对激酶活性控制有影响,在R^-B^-宿主中也发挥类似的适应性修饰行为。Tsr-E385I、L、M突变株受体虽然具有激酶活性,但是无法对高浓度的丝氨酸做出反应。这类突变株在R⁺B⁺的宿主中都能够对丝氨酸刺激做出反应,但是仍具有以下几点不同:例如,E385I突变株受体（极好的Che R修饰底物）和E385M（较差的Che R修饰底物）都能够展现非常好的激酶活性。Tsr-E385I突变株受体对丝氨酸的反应也表现出与列阵重塑过程一致的缓慢动力学特征。因为感觉适应系统增加了它们的激酶活性,与野生型相反,这些突变株受体被归为“倒置”类突变株。5、具有信号锁定传导特性的突变株Tsr-E385P和Tsr-R388D、E突变株受体在UU2567（R^-B^-）和UU2700（R⁺B⁺）宿主中都没有激酶活性的产生。实际上,Tsr-R388E突变株受体能够产生比野生株更多的荧光聚集簇。所以,“锁定-OFF”状态的突变株并不是由于核心受体复合物的形成受到影响所致。Tsr-R388D和Tsr-R388E突变株受体能够被Che R高度修饰,这与天然的OFF信号输出状态保持一致。Tsr-E385P突变株不具有天然的受体尖端结构,它不是Che R和Che B的优选作用底物,突变株的甲基化螺旋束位于任一适应酶的优选底物构象之外。Tsr-E385K、R、D、C突变株受体在UU2567（R^-B^-）和UU2700（R⁺B⁺）中都具有不能够渗透的激酶活性。与“倒置”类突变株受体相似的是,这类突变株受体在感觉适应性酶存在的宿主中具有良好的激酶活性,且对Che R和Che B展现出了不同的底物特异性。Tsr-E385K、R和Tsr-R388D、E的突变株受体信号的传导特点比不带电荷的氨基酸替代产物表现更为极端。野生型Tsr中E385与R388形成盐桥结构,电荷反转其中一个残基侧链,导致E385-R388位置残基侧链之间的电荷排斥,这会造成局部结构的不稳定,从而导致锁定的信号输出状态。结果表明,在有感觉适应性酶的宿主中,4个电荷逆转双突变株能够产生适当的激酶活性,并且下调该活性。然而,双突变株并没有表现出感觉适应性,并且在软琼脂试验中丧失了丝氨酸趋化性。综上,本研究发现E385-R388之间的盐桥对于受体的稳定性是非必需的。受体的活性水平能够调节受体信号单元之间的连接,从而对外界刺激做出反应。同时发现了受体列阵在重塑过程中可涉及Che W和Che A.P5之间界面1和界面2之间的活性依赖性变化。并提出了受体尖端对信号传导的双态操作模型,对于揭示大肠杆菌趋化性受体具有重要的科学意义。