围产期窒息或各种其它原因引起的缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)仍是新生儿死亡或远期运动、智力障碍的常见原因，临床上仍缺乏安全有效的治疗措施。迄今对新生动物HIBD的实验性治疗包括药物性治疗(兴奋性氨基酸受体拮抗剂、钙通道阻断剂、自由基清除剂、一氧化氮合酶抑制剂等)和非药物性治疗(如亚低温等)。 亚低温是指采用人工诱导方法将体温下降2-6℃，以达到治疗目的。近年来大量研究表明，亚低温对HIBD新生动物具有明显的神经保护作用，其机制主要有以下方面：降低脑细胞耗能和无氧代谢；减少兴奋性神经递质过量释放及其受体的激活；阻断细胞内钙离子积聚，抑制氧自由基和一氧化氮大量生成，减轻脑水肿，抑制少突胶质细胞活化，抗神经细胞凋亡等。因此，亚低温的作用是多途径多靶点非特异的，优于其它任何药物性治疗，且具有简便、快捷、安全等优点，被认为是新生儿HIBD临床治疗最具有潜力的措施之一。 大量的临床和实验室研究表明亚低温特异抑制HIBD引起的神经元凋亡而对坏死神经元无效，其确切机制仍不清楚。HIBD后神经元凋亡的启动十分复杂，与某些信号转导通路的活化如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)的活化及作用密切相关，而线粒体在细胞凋亡的调控中起到关键作用，线粒体功能障碍是HIBD后细胞凋亡的中心环节，保护线粒体功能有助于减轻HIBD后的细胞凋亡。本研究拟通过对凋亡发生不同阶段(可逆阶段和不可逆阶段)特殊事件的研究明确亚低温抑制HIBD后细胞凋亡的确切机制，为亚低温治疗新生儿缺氧缺血性脑病提供理论依据。 实验研究发现HIBD后期的运动、智力发育障碍与中枢胆碱能神经系统的关系密切，中枢胆碱能神经主要分布于海马、纹状体、皮层等缺氧缺血易损区；乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)是中枢胆碱能神经系统的一种重要递质，参与学习记忆等相关的重要生理活动。因此，维持中枢胆碱能神经系统的功能正常对改善HIBD引起的运动及学习、记忆障碍至关重要。石杉碱甲(Huperzine A, HupA)是一种可逆的、选择性的胆碱酯酶抑制剂，通过抑制乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)活性，可增加中枢ACh含量进而改善成年动物学习记忆功能障碍和老年痴呆患者健忘症状。其对新生动物的作用未见报道，因此，本研究采用新生大鼠HIBD模型初步探讨HupA是否具有改善学习记忆功能和脑保护作用。复旦大学博士研究生毕业论文亚低温、石山碱甲对新生大鼠缺氧缺血脑损伤的保护作用及机制第一部分亚低温减轻新生大鼠缺氧缺血脑细胞凋亡的作用及机制研究 目的探讨亚低温减轻新生大鼠缺氧缺血脑细胞凋亡的作用及机制。 方法采用7d龄spragUe一Dawley(sD)清洁级大鼠，建立新生大鼠扭BD标准模型。模型动物随机分为常温缺氧缺血组(州，肛温二37℃)和亚低温缺氧缺血组aH，肛温二33℃);对照组(CN和C均为假手术动物。于各种处理后6、72h处死大鼠，取背侧海马冠状平面采用脱氧核糖核昔酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记(TtJNEL)结合苏木素一伊红(H&E)、神经元Nissl染色、电镜观察凋亡小体和海马皮层组织DNA电泳检测脑细胞凋亡情况。于各种处理后0、6、24、48、72h处死大鼠，取结扎侧海马、皮层组织采用免疫印迹法(Western blotting)检测MAPK成分磷酸化P42/44 ERK印一ERKI/2)、磷酸化p一38MApK印一p38)的变化时程及其意义，westem blotting加免疫组织化学法观察线粒体及胞浆细胞色素。(Cytc)蛋白改变;O、2、6、24、48、72h检测线粒体三磷酸腺昔(ATP)合成量并观察线粒体的超微结构变化，用逆转录一聚合酶联反应(RT一PcR)检测caspase一3 mRNA表达情况，显色底物天冬氨酸一谷氨酸一缘氨酸一天冬氨酸一7一氨基一三氟甲基香豆素 (DEVD一AFC)测定casPase一3酶的活性。 结果(l)IN组海马CAI区TU刊rEL阳性锥体细胞明显增多，典型的“凋亡小体”细胞数量增多，DNA电泳梯状条带明显。72h亚低温显著降低脑细胞凋亡发生率(尸<0.01)，而细胞坏死发生率无明显改善，同时DNA电泳梯状条带也明显受到抑制，“凋亡小体”细胞数量也有所减少。(2) HIBD后MApK信号转导系统活化，p一ERKI/2水平在IN组结扎侧大脑组织6h后可见显著降低，24h及48h仍有明显的降低，72h仍未见到显著改善维持在较低的表达水平;相反，p一p38水平在6h后可见显著升高，其后有下降趋势，但24h、48h仍有很高水平的表达，其后表达水平显著下降，至72h接近正常水平。亚低温治疗可逆转二者的反向变化。(3)线粒体ATp合成量2h开始下降，24h下降最明显达正常对照组36%(六0.01)，亚低温治疗能显著改善线粒体ATP合成量，以亚低温治疗24h升高最明显(P<0.ol)。(4)线粒体形态结构的观察显示俐组大鼠脑线粒体肿胀，靖模糊、断裂明显，基质电子密度增高或出现部分透明区，少数线粒体空泡变性，而亚低温治疗后大部分线粒体结构保持完整。(5)IN组胞浆Cytc水平6h开始明显升高，之后持续升高，72h达最高，而线粒体内Cytc水平6h可见显著下降，之后则维持在一较低水平。亚低温治疗组胞浆Cytc水平显著降