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目的:类风湿性关节炎(RA)是一种常见的慢性自身免疫性疾病,以滑膜关节慢性炎症反应和关节损伤为主要临床表现。抗环瓜氨酸肽抗体(ACPA)能在70%-80%的RA患者中检出并且诊断特异性可达98%,ACPA可先于临床表现10年出现并能够预测临床结果,为RA患者的诊断和治疗提供依据。ACPA的检测是基于抗原抗体特异性结合反应,所以,抗原的标准化对ACPA的检测结果至关重要。蛋白质抗原或多肽的瓜氨酸化是一种蛋白质翻译后修饰过程,并且与RA的发病过程及抗体的产生有关。研究发现瓜氨酸化EB病毒核抗原-1(EBNA-1)蛋白序列中存在能被ACPA识别的抗原表位。本研究首先建立一种自身抗体识别抗原表位的筛选方法,并应用此筛选方法,通过对瓜氨酸化EBNA-1候选多肽与ACPA阳性血清和阴性血清的反应性,筛选出与ACPA有最佳反应的多肽或多肽组合,为ACPA检测提供最佳的抗原。方法:1.抗原表位筛选方法的建立:制备BBS酶标微孔反应板,作为通用酶标反应板。将生物素化牛血清白蛋白包被聚苯乙烯酶标微孔反应板,向微孔反应板中加入链霉亲和素,形成生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素(Bio-BSA-SA,BBS)酶标反应板。以生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素酶标微孔反应板为通用微孔反应板,依次加入N末端生物素化抗原肽,阳性血清,HRP标记的羊抗人IgG抗体,形成固相生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素-生物素化抗原肽-抗CCP抗体-HRP标记的羊抗人IgG抗体复合物,加入底物显色,测量OD值。进行生物素化多肽和羊抗人IgG抗体的最佳稀释度和最适反应时间的优化,确定表位筛选的最佳反应条件。对所建立的自身抗体识别抗原表位筛选方法进行方法学评价,确认该方法的可靠性。2.ACPA识别表位的筛选:选取临床血清标本共120例(其中包括患者血清100例,健康体检者血清20例)用于多肽的筛选。采用欧蒙抗环瓜氨酸肽(anti-CCP)抗体IgG检测试剂盒(酶联免疫吸附法)检测血清标本,以此结果作为抗CCP抗体检测金标准,将所选血清抗CCP抗体结果按照欧蒙抗环瓜氨酸肽(anti-CCP)抗体IgG检测结果分为抗CCP抗体阳性组和抗CCP抗体阴性组。按照抗原表位筛选方法对候选多肽进行筛选试验,以多肽对应吸光度值与空白吸光度值的比值确定该多肽和血清标本的结合强度(P/N比值)。筛选出最优肽段及多肽最佳并联组合,评价其是否有潜能作为检测ACPA的抗原。结果:1.抗原表位筛选方法的建立:应用制备的生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素通用酶标微孔板进行抗原表位筛选试验最佳的抗体稀释比例为:生物素化瓜氨酸抗原肽浓度为5.0μg/mL,HRP-抗人IgG抗体稀释度为1:12000(2.0μg/mL)作为最佳条件的稀释比例。生物素化牛血清白蛋白和链霉亲和素的包被浓度分别为4.0μg/mL和10.0μg/mL。最后,方法学评价结果显示,该方法的批内和批间的精密度均较好,变异系数均小于6.0%,阴性和阳性对照血清结果稳定性较好,变异系数均小于5.0%。可用于自身抗体识别抗原表位的筛选试验。2.ACPA识别表位的筛选:5种多肽(表位)均与血清抗CCP抗体有较强的反应性,各自的诊断性能情况分别为:E1检测灵敏度(62.3%),特异度(71.2%),ROC曲线下面积(AUC)0.695;E2检测灵敏度(60.7%),特异度(91.5%),AUC(0.817);E3检测灵敏度(42.6%),特异度(67.8%),AUC(0.588);E4检测灵敏度(82.0%),特异度(83.1%),AUC(0.872);E5检测灵敏度(68.9%),特异度(98.3%),AUC(0.843)。其中E4的反应灵敏度和特异度最好,ROC曲线下面积最大;多肽并联中,E4和E5联合的检测灵敏度及特异度均为最高,分别为94.4%,81.7%。结论:1.应用生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素通用酶标反应板进行抗原表位筛选试验方法的检测精密度、特异度、敏感性和稳定性均较好,能够满足筛选抗原表位的试验需求。该试验方法可对多种不同抗原表位(肽段)进行筛选。2.五条多肽均能与ACPA反应,其中E4的反应灵敏度和特异度最好,ROC曲线下面积最大,诊断分析性能最好。并联多肽中,E4和E5的并联结果的联合灵敏度及特异度最高,组合效果最好。E4人工合成瓜氨酸化EBNA-1多肽或E4和E5的并联应用最可能用作检测ACPA的抗原。