超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)是一类能够水解青霉素,第一代、第二代、第三代头孢菌素及氨曲南等抗生素的一种酶,能够被酶抑制剂所抑制,但对头霉素、碳青霉烯类抗生素敏感。携带这种酶的细菌可以水解相应的抗生素从而导致治疗失败。近年来,产ESBL微生物在世界范围内不断出现,广泛分布于医院临床、社区环境以及畜牧环境中。该酶主要存在于大肠杆菌以及克雷伯氏菌,给公共健康带来了极大的威胁。包括三种主要的类型TEM,SHV以及CTX-M,通常位于可移动遗传片段上。另外,菌株的克隆性传播是ESBL基因扩散的另一重要途径。近年来,养殖环境中由于抗生素的大量使用甚至滥用,越来越多的ESBLs在养殖环境中出现。这些动物源性的产ESBL的大肠杆菌会通过各种途径向环境中扩散,甚至通过动物产品进入食物链,给公共卫生带来了潜在的威胁。目前CTX-M是不同环境中主要的流行类型。主要发现于质粒上,在不同的细菌之间,基因能够水平转移进行传递,从而进行耐药的扩散。接合转移使其进行散播的主要方式,通常受到环境等其他因素的影响。膨润土是以蒙脱石为主要成分的粘土类物质,我国产量丰富,主要成分为SiO2和Al2O3。膨润土由于具有吸附性好、粘附性、含矿物质等特性,广泛用于畜禽及水产动物饲料添加剂用以吸附动物消化道内的有毒物质,延长饲料通过动物消化道的速度,防止畜禽类非细菌性腹泻。然而,膨润土是否会对耐药基因的转移造成影响,引起了人们的广泛关注。为了解目前我国的养猪环境中产ESBL大肠杆菌的流行情况及其对周围环境的影响,以及饲料添加剂对ESBL基因在细菌之间接合转移的影响极其机制,我们展开了以下的研究。1.养猪环境中猪源产ESBL大肠杆菌的流行情况及分子特点的研究为了解产ESBL大肠杆菌在山东地区的流行情况及其对环境的影响,我们从山东地区的10个猪场中采集猪场粪便样品,猪场内外的空气样品,水和淤泥样品以及土壤样品,分离产ESBL的大肠杆菌,并对其特点进行分析。我们从六个猪场中共分离的到119株产ESBL的大肠杆菌他们分别来自不同的粪便样品和环境样品,另外四个猪场中没有得到产ESBL的大肠杆菌。同一场中来源于粪便和环境样品的产ESBL大肠杆菌在耐药表型方面显示极高的相关性,ESBL基因以CTX-M和TEM为主,同一场中不同来源的分离株ctx-m亚型种类相同,而不同场之间的分离株却不具备这种相似性。这表明,产esbl大肠杆菌在该地区流行较为严重,且会对周围环境造成影响。2.养殖场中粪便的利用引起的产esbl大肠杆菌对土壤的污染情况研究我们以产esbl大肠杆菌为指示菌,分别从粪便、堆肥及土壤中采集样品以进一步研究产esbl大肠杆菌对土壤环境的影响。共分离得到42株产esbl大肠杆菌,其中有29株来自于粪便样品;分离率为72.5%,3株来自于堆肥,分离率为15%;10株来自于场外农田中采集的土壤样品,分离率为12.5%。来自于猪场的样品及来自于土壤的样品都显示了多重耐药,携带ctx-m和tem,主要为ctx-m-14和ctx-m-15亚型,复制子类型以f为主,多种复制子并存,且eric-pcr结果显示三株土壤分离株与粪分离株的同源性高于90%,这表明他们可能来自于同一株大肠杆菌。以上结果说明了土壤中的产esbl大肠杆菌很可能来源于粪便。3.饲料添加剂膨润土对耐药基因ctx-m-15水平传播的促进作用研究ctx-m-15是主要的流行亚型,因此我们以携带ctx-m-15的f16为供体菌,它能够对头孢噻肟产生耐药性但对卡那霉素敏感,携带卡那抗性的bl21(de3)为受体菌建立了体外转移模型,研究饲料添加剂膨润土对这种耐药基因转移的促进作用。结果显示该基因可在不同的大肠杆菌之间发生接合转移,而饲料添加剂膨润土能够提高携带ctx-m-15的质粒的转移频率高达4-20倍。且接合效率受温度及膨润土浓度的影响。当膨润土的浓度为100μg/ml时,这种促进作用最明显。4.膨润土刺激下ctx-m-15耐药基因水平传播的差异蛋白质组研究为研究饲料添加剂膨润土对ctx-m-15基因的促转移机制,我们采用比较蛋白质组学研究膨润土是否存在条件下,接合菌的蛋白质组学变化。将膨润土培养条件下的混合菌提取蛋白进行双向电泳,寻找差异表达蛋白。将双向电泳中的2倍以上,p值小于0.05的差异点用于质谱鉴定。结果显示有48个蛋白进行了差异表达,有29个发生差异表达的蛋白得以成功鉴定。生物信息学分析显示这些蛋白包括25种酶及4个蛋白质,参与多种生物学过程,包括糖酵解、压力应激、转运、蛋白合成、其他物质的合成、碳水化合物的代谢、乳糖代谢、抗生素抗性、甘油代谢、生物膜的形成及细胞趋性。在这些鉴定得到的蛋白中,主要是参与各种生物学过程的酶。这4个主要蛋白,分别为外膜通道蛋白、abc周质转运蛋白、mipa互作蛋白及abc运输atp结合蛋白。5.膨润土刺激下ctx-m-15水平传播蛋白的转录水平及其作用研究根据Genebank上这这四个蛋白的序列,分别设计了四个基因tolC,malE,mipA及ybi T的实时荧光定量引物及全基因扩增引物,对其进行转录水平的研究。结果显示他们在膨润土存在条件下,供体菌,受体菌及接合菌中RNA表达量都呈明显上升趋势,与蛋白变化水平相一致。且在受体菌中变化幅度最大,这表明受体菌对膨润土最为敏感。因此,我们构建了这四个基因的表达载体,并将其转化到BL21(DE3)中,并诱导其表达,将其作为受体菌研究这四个基因对基因结合转移的影响,结果显示以这四株菌为受体菌的接合试验中,转移效率皆升高。