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根据WHO公布的资料,至2003年7月8日,全球29个国家和地区共发生SARS 8096例,死亡774例;中国内地发病5329例,死亡349例。面对这一场突如其来的瘟疫,全球多个国家和地区的实验室参加了SARS病原体的协作研究,并很快取得重大突破。中国香港、加拿大、美国、德国、新加坡和我国内地等国家和地区先后从SARS患者标本中成功分离到新型冠状病毒,经科赫法则(Koch’s postulate)确认新型冠状病毒是本次SARS全球流行的病原体。 SARS 病毒是人类面临的新挑战,许多性状是通过与其它 3 组冠状病毒类推、或者是通过一些理论模型推导出来的。但 SARS 病毒毕竟不是其它 3 组冠状病毒,还需要做大量的实验研究来明确它的来源、演变、复制、转录、基因变异、致病机理、免疫学应答等科学问题。而这一切,则是指导预防和治疗的基础。 本实验将通过对 SARS-CoV 基因组中 5’UTR 末端非编码区的序列分析和功能研究,初步探讨该段序列在病毒复制过程中的作用。 第一部分:SARS-CoV 5’UTR RNA 序列分析 目 的:了解 SARS-CoV 不同毒株 5’UTR RNA 的序列构成特点和差异;了解其空间结构,从而为进一步研究其功能打下基础。 方 法:先从 GenBank 中下载现有 SARS-CoV 全基因组 5’UTR和 5’UTR 片段,采用分子生物学软件 DNAStar-MegAlign 和 BLAST进行序列同源性分析;取其代表株 RNA 序列,经 RNADraw3.0 进行二级结构预测。 结 果:⑴序列同源性:101 个 SARS-CoV 5’UTR 序列中,全长264nt 者 83 株,占 82.2%;18 株有缺失突变,所有缺失位于 5’端。5个点突变位置,点突变率为 1.92×19-4。⑵ SARS-CoV 5’UTR RNA 二级结构预测:RNADraw3.0 分析表明,在 37℃、最小自由能为-79.5kcal时,SARS-CoV 5’UTR RNA 可折叠,形成比较稳定的二级结构。包含4 个茎环结构(stem-loop):Stem-loop-Ⅰ由第 7~31 位核苷酸构成;Stem-loop-Ⅱ由第 42~221 位核苷酸构成,是 4 个茎环结构中最大的,含多个茎环结构,形成复杂的假结;Stem-loop-Ⅲ由第 227~251 位核苷酸构成,Stem-loop-Ⅳ第 252~261 位核苷酸构成。 结 论:⑴ SARS-CoV 5’UTR 序列在各分离株之间同源性比较高,碱基构成保守。⑵ SARS-CoV 5’UTR RNA 的二级结构可形成 4 个茎环结构域,推测可能具有启动子样活性。 第二部分:SARS-CoV 5’UTR cDNA 启动子活性研究 目 的: 研究 SARS-CoV 5’-UTR cDNA 序列在真核细胞中的启动子活性,初步探讨 SARS 病毒(SARS-CoV)复制调控机制。