牛蒡叶绿原酸提取工艺、分离纯化及对病原真菌的活性研究

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绿原酸(chlorogenic acid,CHA)是植物在有氧呼吸过程中产生的一种苯丙素类化合物,是若干植物的植保素,还具有广泛且显著的药理活性,如抗菌、消炎、抗氧化、清除自由基等,是许多中药及茶叶质量控制的指标。CHA的来源主要是从天然植物(包括杜仲叶、金银花、葵花仔、咖啡和可可树)中提取。贵州金银花中CHA含量较稳定约5.3-5.7%,葵花仔中CHA约1.5-3.3%,葵花仁中约2.1-3.5%。本课题组首次发现牛蒡叶中CHA含量较高,是CHA的新来源。鉴于CHA在食品、医药、日用化工等方面的广泛应用,本文主要探讨了牛蒡叶CHA的提取纯化工艺,并研究了CHA对几种真菌的活性。结果如下:(1)牛蒡叶经水和乙醇溶液提取,高效液相法定量,80℃预处理时,得CHA的产率分别为0.62%和1.22%;不经80℃预处理时,产率分别为0.32%和0.58%。表明,80℃预处理可以显著提高CHA的产率。在80℃预处理的基础上,通过单因素实验,获得牛蒡叶CHA的水提取工艺参数为:pH4.0、固液比1∶16、提取温度40℃、提取次数1;金银花水提取工艺参数为:pH4.0、提取2次、不粉碎。综合单因素与正交实验获牛蒡叶CHA乙醇提取的最佳工艺参数为:灭活温度80℃、灭活时间20min、乙醇浓度70%、提取温度40℃、提取时间3.5h、固液比为1∶20。(2)牛蒡叶及金银花经水溶液提取,大孔吸附树脂AB-8柱层析及萃取法分离,得牛蒡叶及金银花CHA粗品,含量分别为31.14%和47.65%;经乙醇溶液提取,大孔吸附树脂AB-8两次柱层析、萃取法分离得高纯度的CHA,含量分别为84.69%和94.37%。牛蒡叶经乙醚脱色、乙醇提取,大孔吸附树脂AB-8柱层析、羟丙基葡聚糖凝胶柱层析、萃取、重结晶等方法纯化,得到白色针状晶体;经薄层层析、熔点测定、高效液相鉴定为单一组分。(3)固体培养中CHA能抑制葫芦刺盘孢、黄瓜尖链孢和疫霉三种植物病原真菌的扩散,并且能够抑制葫芦刺盘孢菌丝的生长;但液体培养中CHA却促进了葫芦刺盘孢菌丝的生长,增加菌丝的干重,降低还原糖的利用。CHA还能对葫芦刺盘孢菌丝细胞膜起到保护作用,若CHA溶液使用前经紫外线照射15min会显著增加其对细胞膜的保护作用。可能因为CHA对菌丝细胞膜的保护作用并非由其本身,而是由其转化成的中间体直接起作用,而紫外线的照射加速了中间体的产生,故保护作用明显增强。
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