研究背景VM是1999年美国Iowa大学的Maniotis和Folberg等人研究报道的一种肿瘤微循环模式。大量研究结果证实VM是某些高度恶性肿瘤组织内的一个功能性微循环,由于无内皮细胞屏障,肿瘤细胞与血液直接接触;因此具有VM的恶性肿瘤临床特征为早期即发生广泛的血道转移,肿瘤患者预后差,5年生存率为零。目前国内外VM的研究尚处于初步阶段,其确切的分子机制尚未明确,VM形成过程中的空间结构基础、VM形成与肿瘤局部微环境关系以及实验性干预等是本研究的探讨内容。研究目的1)人体大样本的回顾性研究在人体除葡萄膜黑色素瘤以外其他部位黑色素瘤组织中是否存在VM和LPPCN,并阐述VM和LPPCN的临床病理意义,在此基础上初步探索MMPs在黑色素瘤VM形成过程中的作用以及LPPCN形成相关分子机制,分析LPPCN形成相关分子生物学通路和蛋白调控,明确凋亡相关蛋白在LPPCN细胞中的表达以及缺氧、IFP和凋亡抑制剂对肿瘤细胞内Endo G和Dnase 1表达的影响。2)观察B16动物移植瘤组织中VM、MV和内皮依赖性血管三种肿瘤血液供应模式随肿瘤体积的不断增大彼此之间的时间依赖关系和空间分布特点。3)观察缺血缺氧以及IFP对黑色素瘤侵袭能力和不同微循环模式形成的影响,阐述其相关分子机制,初步解释肿瘤侵袭能力的改变和VM形成与肿瘤SFP后复发和转移之间的关系。4)针对VM形成相关靶点,利用动物实验探索以VM为靶的干预措施,为临床治疗存在VM的高度恶性肿瘤提供实验依据。研究方法1)收集天津医科大学附属肿瘤医院1984年1月5日～2006年12月20日符合实验条件黑色素瘤标本124例,收集患者发病年龄、性别、生存预后资料、转移、肿瘤大小和发病部位等资料,分析VM和LPPCN在肿瘤组织中的分布和临床病理意义。建立B16黑色素瘤动物移植瘤模型,利用活性炭示踪技术明确VM是否与机体内皮依赖性血管相通,同时利用免疫组化和/或组织化学双重染色和电镜等技术观察动物移植瘤组织中VM和LPPCN结构、分布及彼此之间的关系。2)在动物实验基础上,利用免疫组化技术观察基质金属蛋白酶类物质MMP-2和MMP-9在有VM和无VM肿瘤组织中的表达差别,同时利用免疫组化和TUNEL染色技术筛选LPPCN细胞中表达的凋亡相关蛋白。此外,在细胞培养和动物黑色素移植瘤模型基础上,利用Real-time PCR观察缺氧、IFP和凋亡抑制剂对B16细胞两种核酸内切酶EndoG和Dnasel mRNA表达影响。3)建立B16黑色素瘤动物模型,连续处死动物。利用MVD计数、免疫组化双重染色、电镜等观察随肿瘤体积的增大,VM、MV和内皮依赖性血管时间依赖关系及空间分布。4)建立C57小鼠B16黑色素瘤动物移植瘤模型,制作小鼠后肢缺血模型,观察肿瘤细胞在缺血缺氧环境中的生长速度,VM的数量和分布规律,检测MMPs等肿瘤浸润转移相关蛋白表达;此外在小鼠腹腔和后肢肌肉同时接种B16黑色素,建立移植瘤模型,从mRNA和蛋白水平分析不同微环境对黑色素瘤VM形成和肿瘤侵袭能力的影响。5)基于VM的独特结构以及VM形成过程中的相关蛋白靶点,建立B16黑色素瘤动物移植瘤模型,利用免疫组化染色、明胶酶谱法和电镜等技术研究内皮抑素和多西环素对黑色素瘤生长、基质金属蛋白酶表达及活性和不同微循环模式形成的影响。结果1)除葡萄膜黑色素瘤组织外,人体发生其他部位的恶性黑色素瘤组织中也存在VM,构成VM中的PAS阳性界膜既可连续排列,也可为断续性的,肿瘤细胞分泌PAS阳性物质参与VM形成过程中的基质重塑。动物实验研究结果显示B16动物黑色素移植瘤组织中也存在VM,活性炭示踪实验显示VM为肿瘤的功能性微循环。人和动物黑色素瘤组织中均可见VM、MV和内皮依赖性血管同时存在于肿瘤组织中。统计结果显示44.55%(54/124)患者的瘤组织中存在VM,Kaplan-Meier生存分析结果显示具有VM患者的预后较没有VM的患者差(P≤0.05)。2)黑色素瘤组织中存在LPPCN,HMB45免疫组化染色结果显示这些LPPCN细胞是黑色素瘤细胞。B16动物移植瘤实验结果显示LPPCN多出现于肿瘤生长的早期,位于实体肿瘤的中央。统计结果显示大约40%的人恶性黑色素瘤组织中存在LPPCN,生存分析结果显示具有LPPCN患者的生存预后较无LPPCN的患者差(P≤0.05)。3)肿瘤细胞可分泌Ⅳ型胶原参与VM形成过程中的基质重塑。肿瘤细胞和部分间质细胞均可表达MMP-2、MMP-9,MMP-2、MMP-9在有VM肿瘤组织中的阳性细胞率分别为65.63±7.55和63.25±7.86在无VM的黑色素瘤细胞中的阳性细胞率分别为48.40±5.49和49.79±6.38,两者的差异均具有统计学意义(P＜0.05)。4)LPPCN免疫组化染色表现为caspase-8、caspase-6、caspase-7、TNFα、TRAIL、FAS、和FASL呈阴性,而caspase-9、caspase-3和Bax染色为阳性。TUNEL染色后阳性的肿瘤细胞随机散在分布。Real time-PCR结果显示随培养时间延长缺氧组和对照组B16细胞的Dnasel mRNA表达量均增高(P＜0.05),缺氧组内EndoGmRNA随培养时间延长表达水平呈上升趋势,在6h和8h显著高于对照组(P＜0.05),24h后缺氧组与对照组EndoG mRNA表达量无差别(P＞0.05),同一组中EndoG mRNA表达量明显高于Dnase1 mRNA;腹腔组与后肢组黑色素瘤组织内EndoG和Dnase1 mRNA表达水平无明显差异(P＞0.05);动物缺氧模型肿瘤组织EndoG mRNA表达量显著高于对照组(P＜0.05),Dnase1 mRNA在对照组黑色素瘤内表达增高(P＞0.05)。缺血组和对照组的黑色素瘤组织EndoG mRNA的表达水平均显著高于Dnase1(P＜0.05),其结果与体外细胞培养一致;Caspase抑制剂组和对照组EndoG(P＞0.05)和Dnase1mRNA(P＞0.05)表达几乎没有差别。5)VM、MV和内皮依赖性血管可共同存在于肿瘤组织中;动物实验研究结果显示在黑色素移植瘤形成早期,肿瘤组织内血液供应方式以VM为主,随着时间的推移,MV和内皮依赖性血管数目呈现增加趋势。内皮依赖性血管的数目与肿瘤体积的大小呈高度正相关(r=0.718,P=0.009),VM计数与肿瘤体积的大小成高度负相关(r=-0.77,P=0.003)。6)肿瘤生长早期,缺血组肿瘤生长速度较未缺血组慢(t=0.858,P≤0.05),但到第15天处死荷瘤鼠时两组肿瘤平均体积差异已无显著统计学意义(P＞0.05)。单样本t检验统计结果表明缺血组瘤组织内的VM多于对照组。缺血组黑色素组织HIF-1α阳性率为68.78%,对照组为45.62%,其差别具有显著性(P≤0.05),MMP-2和MMP-9在缺血组的表达率高于对照组(均P＜0.05)。VEGF在缺血组内呈高表达(P≤0.05)。Pearson相关分析结果表明仅缺血组内黑色素瘤细胞HIF-1α的表达水平与该组肿瘤体积(r=0.472,P=0.015)和VM数目呈正相关(r=0.391,P=0.050)。7)腹腔组肿瘤组织中VM明显少于后肢肌肉瘤组织内的VM,其差别具有统计学意义(P＜0.05);后肢组肿瘤细胞CK-18和HIF-1α表达均明显高于腹腔组(均P＜0.05),后肢组肿瘤细胞表达MMP-2和MM-9蛋白和mRNA表达水平均明显高于腹腔组(P＜0.05)。8)多西环素组(D组)与对照组(C组),多西环素+内皮抑素联合组(DE组)与C组的小鼠肿瘤平均体积间差异有统计学意义(P＜0.05);各干预组的MV和VM计数均分别与C组比较有统计学差异(P＜0.05);MMP-9、MMP-2表达的阳性率从高到低均依次为对照组(C)组、内皮抑素组(E)组、多西环素和内皮抑素组(DE)组、多西环素组(D)组,且差别均有统计学意义(F=12.791,F=5.560,P＜0.05);TIMP-2从高到低依次是D组、DE、E组及C组,其差异也均有统计学意义(F=4.638,P＜0.05);明胶酶谱法染色结果显示D组和DE组MMP-9和活性MMP-2条带酶解量灰度值明显低于C组。电镜观察结果显示内皮抑素组瘤组织中内皮依赖性血管中的内皮细胞较为幼稚。结论1)人和动物的黑色素瘤组织均可见到VM的存在。因为VM特殊的形态和结构特点,具有VM的肿瘤组织血道转移率较高,临床疗效不佳,肿瘤患者生存预后差。VM形成具有较为独特的分子调控机制,肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶类物质和一些细胞外基质参与VM形成过程中的基质重塑。2)在凋亡相关蛋白调控下,部分肿瘤细胞可形成LPPCN,LPPCN的形成是VM和内皮依赖性血管形成的空间结构基础,具有LPPCN的肿瘤患者临床预后较无LPPCN的肿瘤患者差。核酸内切酶EndoG和Dnase 1可能与黑色素瘤LPPCN形成具有一定关系,这两种酶的表达与肿瘤细胞局部缺氧微环境有密切联系。3)在黑色素瘤生长的不同阶段,存在血液供应“三阶段”现象。4)肿瘤局部缺氧微环境和IFP对VM形成和肿瘤细胞侵袭能力有重要影响。在缺氧环境下,黑色素瘤细胞高表达HIF-1α,HIF-1α可上调MMP-2和MMP-9的蛋白表达,降解ECM,促进肿瘤细胞浸润和VM形成;当肿瘤局部IFP增加时,肿瘤细胞可分泌更多的基质金属蛋白酶类物质降解ECM,促进VM形成。5)多西环素和内皮抑素可以抑制黑色素瘤组织基质金属蛋白酶的表达和内皮细胞的成熟,影响黑色素瘤血液供应的VM和内皮依赖性血管的形成,抑制黑色素瘤的生长,可作为潜在的具有VM的恶性肿瘤一种治疗手段。