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酪蛋白约占牛奶总蛋白的80%,是牛奶中的主要营养成分。酪蛋白主要由αs1-、αs2-、β-、κ-酪蛋白组成,其中αs1-酪蛋白是牛奶中的主要过敏原,可引发皮肤、呼吸道、胃肠道等过敏,但目前尚缺乏特异性的去除方法。由于酪蛋白营养丰富,含有人体所需的全部氨基酸,因此优先性降解酪蛋白中的αs1-酪蛋白显得尤为重要,并对开发低敏牛奶制品具有重要意义。基于此,本课题探究利用蛋白酶优先降解酪蛋白中αs1-酪蛋白的条件。主要研究内容如下:(1)通过对土壤中微生物的筛选,经平板多次筛选后获得一株地衣芽孢杆菌Baclicus licheniformis,命名为Baclicus licheniformis CN1,研究发现,B.licheniformis CN1发酵上清液添加到牛奶溶液中,牛奶过敏原蛋白αs1-酪蛋白被优先性降解。对筛选获得的野生菌B.licheniformis CN1进行单因素以及正交实验的发酵培养基优化,获得最佳的发酵产酶培养基。其组成为(g·L-1):可溶性淀粉,30;牛肉浸膏,6;K2HPO4,0.5;KH2PO4,0.5;p H 9;发酵条件为发酵周期24 h,发酵温度37°C,接种量6%。(2)对B.licheniformis CN1蛋白酶进行纯化以及酶学性质的研究。发酵上清经硫酸铵沉淀和疏水交换实现对蛋白酶的纯化,其分子量约为30.5 k Da,并对纯化后的蛋白酶进行N端测序,获得蛋白酶的氨基酸组成。以酪蛋白为底物测定酶学性质,发现该酶的最适反应p H为p H 10,最佳应用温度为50~60°C,并进一步探求了其对温度和p H的稳定性。(3)研究蛋白酶对牛奶过敏原αs1-酪蛋白的降解条件,控制反应温度和反应p H获得优先酶解αs1-酪蛋白的条件为:酶(100 U·m L-1)与底物的添加比例为4%,温度在50~60°C范围内,反应p H为p H 9,酶解反应时间20 min。同时将该酶与降解过敏原酪蛋白的商品化酶蛋白酶M和肽酶R进行降解效果的比较,发现其对牛奶过敏原蛋白的降解具有优先性。免疫印迹反应研究发现,过敏原降解反应初期,αs1-酪蛋白致敏性消失,但其降解产物中仍含有抗原表位,反应进行20 min后致敏原完全消失。(4)利用海藻酸钠固定化蛋白酶,探求其对牛奶过敏原αs1-酪蛋白的特异性降解。首先研究固定化酶的条件,获得最优固定化酶条件为:Ca Cl2的质量分数为3.0%,海藻酸钠质量分数为4.0%,固定化时间0.5 h,海藻酸钠和酶液的体积比为1:3,固定化效率达到67.5%;然后研究固定化酶的酶学性质,确定固定酶的最适反应温度为70°C,最适反应p H 10,连续使用6次后剩余酶活达到40.0%以上;将固定化酶作用于牛奶溶液中,60°C条件下反应25 min,过敏原αs1-酪蛋白得到特异性降解。