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糖尿病（diabetes mellitus, DM）是一组以高血糖引起胰岛素抵抗为主要标志的代谢紊乱综合征，可导致多种并发症，比如糖尿病肾病,糖尿病视网膜病变,糖尿病心肌病。脂肪组织是一种内分泌器官，可分泌多种脂肪因子，如脂联素、瘦素、内脂素、IL-6等。大量的实验证据表明，脂肪因子影响多种组织的葡萄糖代谢。Chemerin又被称为维甲酸受体反应元件2（retinoicacid receptor responder protein2, RARRES2）或者他扎罗汀诱导基因2（Tazarotene-induced gene2, TIG2），是最近发现的一种脂肪因子,与炎症,脂肪代谢和胰岛素抵抗等具有相关性。已有研究证明，Chemerin及其受体—趋化因子样受体1（chemokine-like receptor1,CMKLR1或ChemR23）在许多组织中表达，特别是在白色脂肪组织、肝脏和肾脏中表达较。目前的研究显示，人类血浆chemerin的高表达是炎症和代谢综合症的标志物之一。因此，Chemerin可能参与了胰岛素抵抗和糖尿病的发生发展。然而，在不同的细胞中，chemerin在胰岛素抵抗中发挥的作用尚存争议。最近的一项研究发现人类骨骼肌细胞虽然不表达chemerin，但是表达chemerin的受体CMKL1。Chemerin通过破坏胰岛素信号，可诱导骨骼肌细胞产生胰岛素抵抗。但是，在体外3T3-L1细胞的研究中尚存争议。Takahashi等发现chemerin能够促进胰岛素刺激下的3T3-L1细胞对葡萄糖的摄取，而Kralisch S等发现chemerin抑制胰岛素刺激下3T3-L1细胞对葡萄糖的摄取率的增加。这种相反结果的产生可能与chemerin同时参与胰岛素作用的靶组织对胰岛素敏感性的负性调节有关。国外已有研究证实大鼠心脏组织表达chemerin及其受体CMKLR1，但是尚无体外实验报道心肌细胞表达chemerin以及chemerin在心肌细胞胰岛素抵抗中的作用。糖尿病心肌病是糖尿病的一个重要并发症，因此我们从细胞水平研究在心肌细胞中chemerin/ChemR23系统与胰岛素抵抗的关系。本实验体外培养SD乳鼠原代心肌细胞和心脏成纤维细胞，检测心肌细胞和心脏成纤维细胞是否表达chemerin，并探讨心肌细胞chemerin的表达与胰岛素抵抗的关系及其分子学机制。本研究主要包括以下四部分：第一部分Chemerin在乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞中的表达目的：购买出生2~3天的SD乳鼠，成功提取并培养SD乳鼠原代心肌细胞和心脏成纤维细胞，观察其是否表达chemerin，为下一步研究奠定基础。方法：购买出生2~3天的SD乳鼠，提取并培养原代心肌细胞和心脏成纤维细胞，应用Real-Time-PCR、Western-Blot技术观察心肌细胞和心脏成纤维细胞是否表达chemerin。结果：Real-Time-PCR结果示乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞均有chemerin mRNA的表达。Western-Blot结果示乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞均有chemerin蛋白的表达结论：SD乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞正常情况下均能够表达chemerin。第二部分高糖和炎症环境下乳鼠心肌细胞chemerin表达的变化目的：观察高糖和炎症因子TNF-α对乳鼠心肌细胞chemerin mRNA表达的影响方法：购买出生2~3天的SD乳鼠，提取并培养原代心肌细胞，培养48小时后换为无血清的低糖DMEM培养基（葡萄糖浓度为5.5mmol/L）继续培养24小时，然后分组后继续培养：1观察葡萄糖干预心肌细胞后chemerin mRNA表达的变化：（1）不同浓度的葡萄糖干预24小时：对照组(5.5mmol/L)组、10mmol/L组、20mmol/L组、30mmol/L、40mmol/L组和高渗组(5.5mmol/L葡萄糖+34.5mmol/L甘露醇）。应用Real-Time PCR技术检测各组心肌细胞chemerin mRNA的表达。（2）30mmol/L的葡萄糖干预不同时间：0小时、6小时、12小时、24小时和48小时。应用Real-Time PCR技术检测各组心肌细胞chemerin mRNA的表达。2观察TNF-α干预心肌细胞后chemerin mRNA表达的变化：（1）不同浓度的TNF-α干预24小时：空白对照组、5ng/ml组、10ng/ml组和20ng/ml组。应用Real-Time PCR技术检测各组心肌细胞chemerin mRNA的表达。（2）20ng/ml的TNF-α干预不同时间：0小时、6小时、12小时、24小时和48小时。应用Real-Time PCR技术检测各组心肌细胞chemerin mRNA的表达。结果：1高糖可诱导乳鼠心肌细胞chemerin mRNA的表达增加。（1）随着葡萄糖干预浓度的增加，心肌细胞chemerin mRNA的表达随之增加，在葡萄糖浓度30mmol/L组达到峰值，差异与对照组比较有统计学意义（P<0.05）；40mmol/L组较30mmol/L组表达降低，但差异无统计学差异（P>0.05）；与对照组相比，高渗组chemerin mRNA的表达并没有明显的变化，差异无统计学意义（P>0.05）。（2）随着葡萄糖干预时间的延长，心肌细胞chemerin mRNA的表达水平随之升高，在24小时达到峰值，差异有统计学意义（P<0.05）；48小时组较24小时表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）。2TNF-α也可诱导乳鼠心肌细胞chemerin mRNA的表达增加。（1）随着TNF-α干预浓度的增加，心肌细胞chemerin mRNA的表达随之增加，在TNF-α浓度20ng/ml组达到最高值。5ng/ml组与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），10ng/ml组、20ng/ml组与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05)。（2）随着TNF-α干预时间的延长，心肌细胞chemerin mRNA的表达水平随之升高，在24小时达到峰值，差异有统计学意义（P<0.05）；48小时组较24小时组表达略降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：高糖环境中和炎症状态下乳鼠心肌细胞chemerin mRNA的表达均上调。第三部分Chemerin诱导心肌细胞产生胰岛素抵抗目的：探讨chemerin是否破坏胰岛素信号，引起心肌细胞的胰岛素抵抗。方法：购买出生2~3天的SD乳鼠，提取并培养原代心肌细胞，培养48h后换为无血清的培养基继续培养24h，然后进行分组。首先以不同浓度的chemerin（对照组、10ng/ml组、100ng/ml组）干预24小时，然后以10-7mol/l胰岛素刺激30分钟。应用Western-Blot技术检测心肌细胞Akt、IRS-1和AMPKα的磷酸化水平，应用荧光酶标仪测定心肌细胞的葡萄糖摄取率（glucose uptake）。结果：无胰岛素刺激组和胰岛素刺激组，随着chemerin浓度的升高，Akt的磷酸化水平均随之降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；无胰岛素刺激组和胰岛素刺激组，随着chemerin浓度的升高，IRS-1的磷酸化水平均随之升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。无胰岛素刺激组和胰岛素刺激组，随着chemerin浓度的升高，葡萄糖摄取率与AMPKα(Thr172)的磷酸化水平也随之降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：Chemerin诱导心肌细胞产生胰岛素抵抗。第四部分Chemerin诱导心肌胰岛素抵抗的分子机制目的：探讨chemerin诱导心肌细胞产生胰岛素抵抗的分子机制方法：购买出生2~3天的SD乳鼠，提取并培养原代心肌细胞，培养48h后换为无血清的培养基继续培养24h，然后进行分组。1探讨chemerin可激活哪些信号通路：首先以0ng/ml或者100ng/mlchemerin干预心肌细胞24小时，然后以10-7mol/l胰岛素刺激30分钟。应用Western-Blot技术检测心肌细胞p38MAPK、ERK-1/2和JNK的总蛋白水平和磷酸化水平。2ERK1/2信号通路在chemerin诱导心肌细胞产生胰岛素抵抗中的作用：应用ERK阻滞剂PD98059（50umol/l）预干预15分钟，之后Chemerin（100ng/ml）干预24小时，最后应用胰岛素（10-7mol/l）刺激30分钟，具体分组如下：①空白对照组；②胰岛素组；③Chemerin组；④Chemerin+胰岛素组；⑤PD98059+chemerin组；⑥PD98059+chemerin+胰岛素组。应用Western-Blot技术检测心肌细胞Akt和AMPKα的磷酸化水平；应用荧光酶标仪测定心肌细胞的葡萄糖摄取率。结果：1胰岛素刺激后，chemerin可激活ERK1/2与p38MAPK信号通路：无胰岛素刺激组，chemerin干预后， p38MAPK的磷酸化水平较对照组无明显升高，差异无统计学意义(P>0.05)；但胰岛素刺激组，p38MAPK磷酸化水平较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。无胰岛素刺激组与胰岛素刺激组，chemerin干预后，ERK-1/2的磷酸化水平均较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)。无胰岛素刺激组与胰岛素刺激组，chemerin干预后，JNK的磷酸化水平均较对照组无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。2ERK1/2阻滞剂可部分逆转chemerin诱导的心肌细胞胰岛素抵抗：胰岛素刺激组，chemerin和PD98059干预后，Akt的磷酸化水平较单纯chemerin干预组升高，但仍较无chemerin干预的对照组降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；AMPKα的磷酸化水平和葡萄糖摄取率也有类似的变化，差异具有统计学意义(P<0.05)结论：胰岛素刺激后，chemerin可激活ERK1/2和p38MAPK信号转导通路；chemerin可部分通过激活ERK1/2信号传导通路诱导心肌细胞产生胰岛素抵抗。