以往观点认为,神经元—神经元间的网络联系是神经系统发挥功能的唯一途径,而神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞等)仅被视为是神经元的被动的、辅助性的伙伴。近年人们对星形胶质细胞的功能有了新的认识。星形胶质细胞除了营养支持的功能外,还可以调节神经元间化学突触的信息传递及调控脑内神经血管舒张-收缩藕合。此外,它可与神经元形成“三成份突触”直接参与信息交流。特别是星形胶质细胞可以释放类似于神经递质的“胶质递质”以主动响应外界的刺激。这些胶质递质包括谷氨酸、三磷酸腺苷(ATP)等小分子物质,它们不但参与了突触传递长时程增强(LTP)机制,成为学习记忆的基本要素,也参与了脑血流量调控、神经创伤、神经病理性疼痛等生理和病理过程。但这些胶质递质的释放机制仍不清楚。目前研究认为,在星形胶质细胞内,谷氨酸的释放是以钙离子依赖的“Kiss-and-run”模式为主的量子化释放;而ATP的量子化释放假说虽也得到一些间接的证据支持,但在生理条件下ATP的释放机制仍不确定。因此,本论文的第一部分将着重探讨星形胶质细胞ATP的释放机制。作为神经元-胶质细胞间信息交流的活跃信号分子之一,ATP还是神经系统内一类重要的传递伤害性信息的信号分子,参与痛信号的形成、传递以及胶质细胞的活化。当前有关神经病理性疼痛的新观点认为,除神经元的作用以外,胶质细胞(包括星形胶质细胞、小胶质细胞)的活化非常关键。神经损伤后小胶质细胞迅速出现明显的募集与活化,星形胶质细胞也出现类似变化,但相对出现较晚而且发展较慢。而不同胶质细胞间如此复杂而又精确的激活时间谱(temporal pattern)有赖于神经元-胶质细胞间、胶质细胞-胶质细胞间完美的协调与整合,但其间的协调信号尚不清楚。ATP的相关受体广泛分布于神经系统内,已有证据表明P2X4和P2X7受体在神经病理性疼痛中起了重要作用,但仍有很多问题需要进一步明确:例如这些受体在胶质细胞和神经元上是持续存在还是疼痛时暂时性出现?它们在小胶质细胞、星形胶质细胞上的表达变化与神经病理性疼痛不同的时相有何关系?为此,我们研究了在神经病理性疼痛不同时间点(建模后10、20、30天)上脊髓背角的星形胶质细胞、小胶质细胞及其上P2X4、P2X7受体亚型间的动态关系。在本论文的第二部分,我们提供了星形胶质细胞、小胶质细胞激活,P2X4,P2X7受体表达与神经病理性疼痛的时程关系提供了系统的实验资料及其分析。第一部分生理刺激诱发的星形胶质细胞内ATP的释放机制研究【目的】通过对刺激诱发的星形胶质细胞ATP和谷氨酸释放动力学特点及相关调节因素的对比研究,探讨星形胶质细胞ATP释放的机制。【方法】(1)原代培养的星形胶质细胞取自出生24小时以内的Sprague-Dawley大鼠的海马,培养14-20天,经细胞纯化后使用;(2)将谷氨酸AMPA受体GluR1和GluR2(flip)亚型的全长质粒共转入HEK293A细胞制备谷氨酸嗅探细胞(Glu-sniffer);将ATP离子型受体P2X4亚型的全长质粒转入HEK293A细胞,制备ATP嗅探细胞(ATP-sniffer);检测其特异性和灵敏度;(3)利用嗅探细胞膜片钳技术(sniff-patch)比较了星形胶质细胞ATP、谷氨酸的释放信号的动力学及星形胶质细胞与大鼠肾上腺嗜铬细胞(RACC)ATP释放动力学的差别;(4)使用微碳纤维电极(proCFE),利用电化学方法测量儿茶酚胺类物质从多巴胺负载的星形胶质细胞及大鼠肾上腺嗜铬细胞(RACC)中的量子化释放的动力学;(5)利用双光子显微镜观察刺激诱发的星形胶质细胞中FM染料的量子化释放过程;(6)利用钙成像系统(钙离子探针为Fura-2 AM)或激光共聚焦显微镜(钙离子探针为Fluo-4 AM或Rhod-2 AM)监测细胞内钙离子浓度的实时变化;(7)利用RT-PCR方法检测星形胶质细胞的P2X7受体及常见的牵张敏感通道的mRNA水平;(8)利用药理学方法,筛查可能与ATP释放相关的分子;(9)利用特异针对大鼠P2X7受体的shRNA慢病毒颗粒获取显著降低P2X7受体水平的大鼠星形胶质细胞并与原代培养的星形胶质细胞进行对比实验;(10)使用蛋白质印迹法测定目的蛋白的表达水平;使用免疫荧光技术分析目的蛋白的分布情况。【结果】“Sniff-patch”技术具有对单个囊泡释放事件的时空分辨能力。利用这一技术,我们确定在模拟生理条件下的牵张刺激时所触发的星形胶质细胞释放ATP和谷氨酸的动力学是截然不同的:谷氨酸是以量子化的途径释放,而ATP是以非量子化途径释放。(1)谷氨酸的释放是钙离子依赖性的,而ATP的释放是非钙离子依赖性的;(2)破坏胶质细胞的溶酶体可以阻断胶质细胞内钙离子依赖性的谷氨酸量子化释放,而不影响ATP的释放;(3)阻断星形胶质细胞线粒体的功能将消除牵张刺激诱发的ATP的释放;(4)使用P2X7受体的阻断剂或使用RNAi技术降低P2X7受体的表达将显著抑制牵张刺激所诱发ATP的释放。【结论】在类似生理条件的刺激下,星形胶质细胞可以同时释放ATP和谷氨酸,但其释放的机制各不相同:谷氨酸是通过钙离子依赖的胞吐途径进行量子化释放,而ATP则是通过非钙离子依赖的P2X7受体通道进行非量子化释放。第二部分脊髓背角胶质细胞及其ATP受体P2X4和P2X7亚型在神经损伤所致的神经病理性疼痛中的时空间动态变化与作用的研究【目的】通过观察、比较脊髓背角内星形胶质细胞、小胶质细胞激活的时空间分布模式及胶质细胞内源性P2X4和P2X7受体表达的时空间模式与神经损伤后出现的异常性触痛时程上的异同点,探讨神经病理性疼痛不同时相分别与星形胶质细胞、小胶质细胞间、P2X4、P2X7受体间的动态关系。【方法】(1)使用成年SD大鼠坐骨神经分支选择性损伤(spared nerve injury,SNI)模型;(2)测量SNI模型大鼠每一时间点(术后0、10、20、30天)机械刺激缩足反应阈值(PWMT)(;3)用蛋白质印迹法检测每一时间点P2X4和P2X7受体的表达水平;(4)用双重免疫荧光染色技术分析每一时间点P2X4和P2X7受体及星形胶质细胞、小胶质细胞的活化状态和分布;(5)用双重免疫电镜染色技术观察P2X4和P2X7受体的超微结构定位;(6)用药理学的方法评估P2X4、P2X7受体及活化的星形胶质细胞、小胶质细胞在异常性触痛中的作用。【结果】(1)SNI手术后,脊髓背角内小胶质细胞的激活高峰期早于星形胶质细胞,在SNI初期,激活的小胶质细胞和星形胶质细胞主要分布在脊髓背角浅层,随时间发展,脊髓背角深层逐渐出现激活态的胶质细胞;(2)SNI术后,小胶质细胞的P2X4和P2X7受体均表现上调,但反应高峰期不同:P2X7受体(术后10天)早于P2X4受体(术后20天);(3)SNI术后,星形胶质细胞内仅表现为P2X7受体的持续表达上调,在本实验中,高峰出现在术后30天;(4)免疫电镜分析显示神经元和胶质细胞均有P2X4、P2X7受体分布;在神经元P2X4受体多分布于突触后成份和线粒体的外膜,而P2X7受体主要分布在突触前成份和线粒体的内膜与嵴上;(5)在不同的时间点使用P2X受体的拮抗剂均可减轻触痛,但镇痛效果不同;抑制胶质细胞的活化也可抑制异常性触痛。【结论】以上结果提示在P2X4受体与P2X7受体之间以及表达这两种受体的星形胶质细胞与小胶质细胞之间存在疼痛信号的交流,P2X4、P2X7受体,星形胶质细胞和小胶质细胞在神经病理性疼痛的不同阶段发挥着不同的作用。SNI后的初始阶段以P2X4受体阳性的小胶质细胞反应为主;而SNI后的持续阶段以P2X7受体阳性的星形胶质细胞反应为主,但P2X4受体阳性的小胶质细胞也参与其中,对两者的抑制均可减轻异常性疼痛,说明在维持阶段出现了星形胶质细胞和小胶质细胞协作,不可或缺,共同维持了疼痛状态,也使神经病理性疼痛的机制复杂化。这也提示我们今后在神经病理性疼痛治疗中应根据疼痛的不同阶段选择不同的治疗靶点和治疗方案。