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目的:本文通过建立与人体正常肝组织、肝纤维化中后期及末期生理硬度相似的体外培养模型,探究转化生长因子TGF-β1与基底硬度即理化协同作用对肝细胞表型改变的影响。
方法:根据文献资料,设计基底膜的硬度为3.6 kPa、10 kPa、30 kPa并建立体外培养模型。此三种硬度的基底膜分别对应正常肝组织和肝纤维化中后期及肝纤维化末期肝组织的硬度。通过TGF-β1浓度梯度实验确定TGF-β1影响肝细胞表型改变的浓度拐点。测出其浓度拐点后,采用形态学观察、计算机图像处理、免疫荧光显微观测、Western Blotting及RT-PCR实验技术研究肝细胞在不同硬度梯度的聚丙烯酰胺基底膜上及TGF-β1处理组中细胞形态变化特征、骨架装配方式、E-钙粘素表达、白蛋白和alpha-平滑肌动蛋白表达的差别;其中E-cadherin、白蛋白是上皮样细胞表型的标志性蛋白而α-平滑肌肌动蛋白是间充质样细胞表型的标志性蛋白。
结果:72小时后,对照组中肝细胞的铺展面积及长短经之比随着基质硬度的增大而增大,细胞骨架也由皮质下环逐渐变为应力纤维丰富且与细胞长轴平行的状态。3.6 kPa TGF-β1处理组细胞骨架与其对照组相比没有明显的差异。但在10kPa、30 kPa基质膜上TGF-β1的加入则进一步促进了骨架纤维的发育。WesternBlotting及RT-PCR的研究结果表明:无论是从蛋白水平还是DNA水平上来讲E-cadherin、白蛋白的表达量随着基质硬度增加而逐渐减少,α-SMA的表达趋势却与之相反。在同一硬度基质膜上,TGF-β1的加入进一步加大了肝细胞表型的改变,即TGF-β1处理组中E-cadherin和白蛋白的表达量与对照组相比进一步减少(无论是在其蛋白水平还是DNA水平上),而α-SMA的表达量却相应增加。
结论:在较软基底上,肝细胞易维持上皮样的表型,而在较硬的基底上皮样表型丧失,TGF-β1的加入进一步促使肝细胞上皮样表型丢失,也即较硬基底增强了细胞对TGF-β1响应的敏感性。