研究背景肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,重威胁着人们的生命健康。据统计在我国肾癌的发病率呈年轻化趋势,且每10万人群中约有37位男性及16位女性患者被确诊为肾癌。由于肾癌患者早期无明显症状,25%-30%患者入院诊断时已为中晚期；同时,肾癌患者对放疗及化疗并不敏感,因此,肾癌患者的主要治疗方式为手术切除,然而20%以上的患者术后可能复发。因此,目前对于肾癌的治疗仍不理想。透明细胞癌是肾癌最常见的组织学类型,约占70%-90%。然而,由于肾透明细胞癌发生及发展的机制尚不明确,对肾透明细胞癌治疗新药物的研发也带来了极大的困难。因此,深入开展肾透明细胞发生及发展方面的基础研究具有重要的意义。近年来,随着分子生物学的快速发展,与肾透明细胞癌发生及发展有关的越来越多蛋白被发现,蛋白标记物的发现不仅有助于肾癌患者的预后评估,同时也有助于临床上对肾癌的诊断、术后局部复发或远处转移的预测、也有望成为分子靶向药物研发的的靶点,应用于临床治疗。因此,寻找与肾透明细胞癌相关的新基因,将有助于阐述肾透明细胞癌发生的机制,为其诊断及治疗提供有价值的参考依据。PGAM1为PGAM家族成员,最初在脑组织内发现,才被命名为PGAM1;另一个成员与PGAM1为同型二聚体,主要存在于成熟骨骼肌和心肌组织中,命名为PGAM2[14-15]。PGAM1定位于人染色体10q25.3区域,全长1709 bp,包括31bp的非翻译区(5’UTR),765-bp的编码区,913bp的非翻译区(3’UTR)。其cDNA编码一个长约254个氨基酸,分子量为28784 Da的蛋白质,其活性位点内的三个氨基酸,分别为Hisll, Arg62和His186。而PGAM2的cDNA编码253个氨基酸和一个较短的非翻译区。PGAM1与PGAM2具有80%同源性,但二者含有不同酸性和碱性氨基酸残基。PGAM2在人类基因组只有一个拷贝数,而PGAM1基因有多个拷贝数。因此,PGAM1基因被认为是PGAM2的祖基因。目前的研究认为PGAM1参与调控糖代谢活动,主要将3-磷酸甘油酸催化生成2-磷酸甘油酸,最终降解为磷酸烯醇式丙酮酸；其表达与肿瘤的发生及发展也密切相关,在结直肠癌、肝癌肺癌及乳腺癌组织中均发现了其表达高于周边正常组织,然而在脑部肿瘤中却发现其表达低于周边正常组织。尽管如此,目前研究并没有检测PGAM1在肾透明细胞癌中的表达目的1、探讨PGAM1在肾透明细胞癌及癌旁相对正常肾组织中的表达及其临床意义。2、探讨PGAM1在在肾透明细胞癌组织中的表达与患者预后的关系。3、探讨PGAM1表达下调对肾透明细胞癌细胞生物学功能的影响及其作用机制。方法1、收集192例肾透明细胞癌组织及80例肾癌远端正常肾组织中,经固定、脱水制成石蜡组织块,采用免疫组化检测PGAM1的表达,并分析PGAM1在肾透明细胞癌组织中的表达与临床病理参数及患者预后的关系。2、采用qRT-PCR定量检测了3对肾透明细胞癌及配对远端正常’肾组织中PGAM1mRNA的表达,同时,通过Western blot定量检测了8对肾透明细胞癌及配对正常肾组织中PGAM1蛋白的表达情况,进一步明确PGAM1在’肾癌及癌旁肾组织中的表达。3、采用qRT-PCR检测了PGAM1在肾透明细胞癌细胞株RLC-310及Caki-2中的表达。同时,行siRNA干扰片段瞬时转染,敲低PGAM1在’肾透明细胞癌细胞株RLC-310及Caki-2中的表达,并行qRT-PCR及Western blot进行验证。4、采用流式细胞仪检测PGAM1表达下调对肾透明细胞癌细胞株RLC-310及Caki-2中凋亡的影响；同时,采用MTT实验检测PGAM1表达下调对肾透明细胞癌细胞株RLC-310及Caki-2增殖的影响。5、通过qRT-PCR及Western blot检测肾透明细胞癌细胞株RLC-310及Caki-2中PGAM1表达下调后,P53、Caspase 3及Caspase 9的表达情况,初步探讨PGAM1发挥生物学功能的机制。结果1. PGAM1在肾透明细胞癌中的表达首先,我们通过免疫组化检测了192例肾透明细胞癌组织及80例肾癌远端正常’肾组织中PGAM1的表达,结果表明PGAM1阳性表达主要定位于细胞质,在正常肾组织及肾透明细胞癌组织中均可见阳性表达。其中,正常肾组织中,阴性表达20例(25.0%),弱阳性表达34例(42.5%),中度阳性表达20例(25.0%),强阳性表达6例(7.5%)；肾透明细胞癌组织中,阴性表达59例(30.7%),弱阳性表达45例(23.4%),中度阳性表达71例(37.0%),强阳性表达17例(8.9%)；统计学分析表明,两组差异明显,具有统计学意义(表1-1,P=0.017)。随后,我们进行了半定量分析,发现PGAM1在肾透明细胞癌中104例(54.2%)呈低表达,88例(45.8%)呈高表达；在正常肾组织中,54例(67.5%)呈低表达,26例(32.5%)呈高表达,统计学分析也显示两组差异明显,具有统计学意义(表1-2,P=0.044)。随后,我们采用qRT-PCR定量检测了三对肾透明细胞癌及配对远端正常肾组织中PGAM1mRNA的表达,结果表明PGAM1在肾透明细胞癌中的表达约为正常肾组织中表达的4.2倍,明显高于正常肾组织,统计学分析表明差异明显,具有统计学意义(图1-2,P=0.004)。 同时,我们通过Western blot也定量检测了8对肾透明细胞癌及配对正常肾组织中PGAM1蛋白的表达情况,结果表明PGAM1蛋白在肾透明细胞癌中的表达为正常肾组织中的3.2倍,明显高于正常肾组织,统计学分析表明差异明显,具有统计学意义(图1-2,P=0.001)同时,我们也探讨PGMA1在肾透明细胞癌表达与临床病理特征的关系。结果显示：PGMA1表达与年龄、肿瘤大小及T分期相关,而与性别、肿瘤位置及吸烟史无明显相关。其中,92例年龄>57岁患者中12例患者PGMA1呈高表达,其高表达率明显低于<57岁患者(43/100),差异具有统计学意义(P=0.005)。58例肿瘤直径≥5 cm患者中,34例患者呈高表达,其高表达率明显高于肿瘤直径<5 cm的肿瘤患者(54/134),差异具有统计学意义(P=0.0027)。80例T2-T3患者中,46例呈PGAM1高表达,其高表达率明显高于T1期患者,差异明显,具有统计学意义(P=0.008)。2.肾透明细胞癌中PGAM1表达与患者预后的关系依据肾细胞癌患者的预后相关资料,我们采用Kaplan-Meier法探讨了临床病理特征与肾透明细胞癌患者预后的关系,结果表明肾透明细胞癌患者的预后与PGAM1表达、肿瘤大小及T分期密切相关。其中,PGAM1高表达患者的平均生存时间为48月,明显低于PGAM1低表达患者的平均生存时间(56月),差异具有统计学意义(P=0.000)。同时,结果显示肿瘤直径<5 cm患者的术后平均生存时间为55月,明显高于肿瘤直径≥5 cm的患者(47月),差异具有统计学意义(P=0.000)。T1患者的平均生存时间为55月,明显高于T2-T3期患者(49月),差异明显,具有统计学意义(P=0.000)。然而,年龄、性别、肿瘤位置及吸烟史与患者的预后无明显相关(P>0.05)。随后,我们探讨了PGAM1表达与临床病理特征的关系对患者预后的影响。我们发现在年龄<57岁的患者中,PGAM1高表达患者预后明显差于低表达患者(P=0.000)；而在年龄>57岁的患者中,PGAM1表达与预后无明显相关(P=0.203)。在男性患者中,PGAM1高表达患者预后明显差于低表达患者(P=-0.000)；同样,在女性患者中,PGAM1高表达患者预后明显较差(P=0.013)。在左侧肾透明细胞癌中,PGAM1高表达患者预后明显差于低表达患者(P=0.000)；而在右侧肾透明细胞癌中,PGAM1表达与预后无明显相关(P=0.579)；在有吸烟史及无吸烟史患者中,PGAM1高表达患者预后均明显差于低表达患者(P=0.000,P=0.006)。在肿瘤小于5cm的肾透明细胞癌患者中,PGAM1高表达患者预后明显差于低表达患者(P=0.000)；而在肿瘤>5cm肾透明细胞癌中,PGAM1表达与预后无明显相关(P=0.47)；在T1期肾透明细胞癌患者中,PGAM1高表达患者预后明显差于低表达患者(P=0.000)；而在T2-T3期肾透明细胞癌患者中,PGAM1表达与预后无明显相关(P=0.945)。多因素回归分析PGAM1及肿瘤大小可作为肾透明细胞癌患者预后评估的独立因素,而T分期并不能作为肾透明细胞癌患者预后评估的独立因素。3.敲低PGAM1表达对肾透明细胞癌细胞生物学功能的影响我们首先通过qRT-PCR检测了PGAM1在肾透明细胞癌细胞株RLC-310及Caki-2中的表达,发现在肾透明细胞癌细胞株RLC-310及Caki-2中均能检测到PGAM1的表达,其中RLC-310中的表达高于Caki-2。随后,我们通过siRNA干扰技术将PGAM1干扰片段瞬时转染了两株细胞,并采用qRT-PCR及Western blot进行了相应的验证。qRT-PCR及Western blot检测结果显示经转染后,PGAM1在RLC-310及Caki-2细胞中的表达均明显下调,差异明显,具有统计学意义(P=0.001,P=0.008),表明RLC-310及Caki-2中PGAM1表达被成功敲低,PGAM1干扰片段成功转染。随后,通过MTT实验探讨了PGM1表达下调对透明细胞癌细胞增殖能力的影响。结果表明在RLC-310细胞中,PGAM1表达下调后细胞增殖时检测到的OD值与对照组相比明显降低(P=0.000),生长曲线较平缓。同样,在Caki-2细胞中,PGAM1表达下调后细胞增殖时检测到的OD值与对照组相比明显降低(P=0.000),生长曲线较平缓,表明PGAM1表达下调后Caki-2细胞增殖能力减弱。同时,采用流式细胞仪检测了PGAM1表达下调对肾透明细胞癌细胞凋亡的影响。结果表明：在RLC-310细胞中,PGAM1表达下调后细胞的凋亡率为15.67%±0.52%,而对照组细胞的凋亡率为5.21%±1.04%,两组经统计学分析,差异明显,具有统计学意义(P=0.000)。在Caki-2细胞中,PGAM1表达下调后细胞的凋亡率为11.83%±1.09%,而对照组细胞的凋亡率为4.81%±1.33%,两组经统计学分析,差异明显,具有统计学意义(P=0.002)。4. PGAM1表达下调发挥生物学功能相关机制的初步研究首先,我们通过qRT-PCR检测了P53、Caspase 3及Caspase 9的在RLC-310肾透明癌细胞株中的表达,结果显示PGAM1表达下调后P53、Caspase 3及Caspase 9表达均明显上调,与对照组相比,差异明显,具有统计学意义(P<0.05)。随后,我们也检测了P53、Caspase 3及Caspase 9的在Caki-2肾透明癌细胞株中的表达,结果也显示PGAM1表达下调后P53、Caspase 3及Caspase 9表达也均明显上调,与对照组相比,差异明显,具有统计学意义(P<0.05)。随后,为了进一步证实PGAM1表达下调对P53、Caspase 3及Caspase 9的影响,我们通过Western blot进行了相应验证。在RLC-310肾透明癌细胞株中的,结果显示：与对照组相比,PGAM1表达下调后P53、Caspase 3及Caspase 9表达均上调。经灰度值检测分析,表明PGAM1表达下调后P53、Caspase 3及Caspase9的OD值明显下降,具有统计学意义(P<0.05),提示GAM1在RLC-31表达下调后上调了P53、Caspase 3及Caspase 9表达。同样,在Caki-2肾透明癌细胞株中的,结果显示：与对照组相比,PGAM1表达下调后P53、Caspase 3及Caspase9表达均上调。经灰度值检测分析,表明PGAM1表达下调后P53、Caspase 3及Caspase 9的OD值明显下降,具有统计学意义(P<0.05),提示GAM1在Caki-2表达下调后上调了P53、Caspase 3及Caspase 9表达。结论：1.PGAM1在肾透明细胞癌组织中的表达明显高于周围正常肾组织,其在肾透明细胞癌组织中的表达与肾透明细胞癌的发生及发展相关。2. PGAM1表达与肾透明细胞癌患者的临床病理特征相关,并影响患者的预后相关,PGAM1可作为肾透明细胞癌预后评估的独立因素。3. PGAM1表达下调具有促进肾透明细胞癌细胞凋亡,抑制其增殖的生物学功能,其作用机制与P53/Caspase 3/Caspase 9信号通路相关。