论文部分内容阅读
研究背景乳腺癌发病率居世界女性肿瘤的第一位,严重危害女性身心健康。目前全球每年约有120万妇女患病,50万妇女死于乳腺癌。近年来我国乳腺癌发病率呈现逐年上升的趋势,并且发病年龄有所下降。因此乳腺癌的防治成为肿瘤研究的重要课题。DLC-1(Deleted in liver cancer-1)是一抑癌基因,在肝癌及其他恶性肿瘤如乳腺癌等常呈低表达或无表达。DLC-1具有抗肿瘤细胞增殖和转移的作用。它的失活将会引起生物学过程的改变并导致恶性表型。DLC-1蛋白含有四个重要的结构域:Rho-GAP(Rho GTPase activating proteins)结构域、SAM (sterileαmotif)结构域、START(steroidogenic acute regulatory protein related lipid-transfer domain)结构域和SR (serine-rich region)结构域。DLC-1的主要功能结构域是Rho-GAP结构域,通过调控Rho蛋白的活性抑制细胞增殖和转移。DLC-1基因失活可使Rho蛋白过度激活,从而向细胞内持续传递生长信号,导致肿瘤的发生和进展加速。抑癌基因失活的机制主要包括遗传学改变和表观遗传学改变。启动子区域的高甲基化是某些抑癌基因失活的原因之一。CpG岛的异常甲基化往往早于细胞的恶性增生,基因组的甲基化往往伴随癌症的发生而出现,并随肿瘤的恶性程度增加而增加,因此对DNA甲基化的检测可用于肿瘤的诊断和预后评估,也是肿瘤研究的热点之一。DLC-1基因在乳腺癌中表达下调,因此,探讨该基因在乳腺瘤中失活的机制尤为重要。基于目前已证实的DLC-1启动子区存在CpG岛的现象,研究抑癌基因DLC-1启动子区的甲基化状态、及其与乳腺癌的相关性,对于理解乳腺癌的发生、发展和转移机制有一定的帮助。目的探究DLC-1基因在MCF-7人乳腺癌细胞系中低表达的可能的机制,检测DLC-1启动子区CpG岛是否存在甲基化现象,研究去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)对MCF-7细胞DLC-1 mRNA及蛋白表达量的影响,并观察5-Aza-CdR处理后对肿瘤细胞迁移能力的影响。建立DLC-1过表达MCF-7细胞模型,并应用免疫荧光染色技术检测DLC-1基因对乳腺癌细胞MCF-7细胞骨架形成的影响。方法1)提取人乳腺癌细胞MCF-7的基因组DNA,Bisulfite处理后用甲基化特异性PCR (MSP)法检测其DLC-1基因启动子区甲基化状况。2)不同浓度5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)处理的MCF-7乳腺癌细胞,观察药物对细胞形态的影响,并通过划痕实验观察5-Aza-CdR处理后对肿瘤细胞迁移能力的影响。3)通过Real-Time PCR、RT-PCR、Western blot技术检测在不同浓度5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-Aza-CdR)处理的MCF-7乳腺癌细胞中DLC-1的表达情况。4)应用阳离子脂质体将DLC-1/pcDNA3.1/Nv5-DESTTM转染MCF-7细胞,建立DLC-1过表达细胞模型,运用免疫荧光染色法检测细胞骨架受该基因的影响。结果1)通过MSP法验证了在乳腺癌细胞系MCF-7中确实存在DLC-1基因启动子的甲基化。2)去甲基化药物5-Aza-CdR处理乳腺癌细胞MCF-7,应用RT-PCR和Real-time PCR、Western Blot方法检测DLC-1 mRNA及蛋白的表达量,实验表明应用去甲基化药物组的细胞比未经药物处理的MCF-7细胞DLC-1的表达量明显增加,且10μmol/L剂量组的表达强度最高。3)应用去甲基化药物5-Aza-CdR处理MCF-7细胞,观察到去甲基化药物能使细胞的生长、迁移速度减缓,药物处理后的细胞的形态发生明显变化,细胞变圆,突起回缩。4)过表达DLC-1基因能够影响细胞骨架的形成。DLC-1过表达的MCF-7细胞骨架结构经FITC-Phalloidin染色显示,细胞胞浆中的微丝较野生型MCF-7细胞明显减少,极性消失,呈粗颗粒状不连续分布在细胞周边,局部收缩聚集成团并形成空泡状结构,并且发现细胞变圆变大,突起回缩。结论1)抑癌基因DLC-1的启动子区CpG岛甲基化是导致该基因低表达的原因之一。2) 5-Aza-CdR能逆转DLC-1基因甲基化状态。3) 5-Aza-CdR能使细胞的生长、迁移速度减缓,药物处理后的细胞形态发生明显变化,细胞变圆,突起回缩。4)恢复表达DLC-1会影响肿瘤细胞骨架形成,可能会影响肿瘤细胞的增殖和转移。