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背景神经元增殖和分化障碍影响创伤性中枢神经系统损伤后的修复和再生,进一步会产生各种各样的神经系统疾病。前期实验结果证明PTEN沉默会促进PC12的增殖和分化,提示PTEN可能以某种特定的方式调控着神经细胞分化。而ERK5在神经系统发育中也起到不可或缺的作用。PTEN可能与ERK5相互调节以确保神经细胞的正常分化。ERK5是近些年发现的一个MAPK家族新成员,与其他MAPK家族成员p38、ERK1/2、JNK1/2/3相比,氨基端同源性较高,而特异性的羧基端包含的转录激活区域和核定位序列,导致ERK5分子量是经典MAPK家族成员的2倍左右。氨基末端包括的激酶区域,用于与上游分子MEK5结合。它在许多组织中普遍表达,并被各种细胞外刺激如细胞应激和生长因子激活,参与到细胞增殖、分化、存活等生理过程中,发挥关键性作用。PC12细胞,即为大鼠嗜铬瘤细胞,来源于大鼠肾上腺。表达NGF(神经生长因子)受体,在多聚赖氨酸的作用下贴壁,可以被NGF诱导分化。它与神经母细胞胚胎起源相同,被认为是未成熟神经元。这使得PC12细胞可作为神经元分化和神经分泌的细胞模型,常用于神经系统研究。通过本课题的研究,探究ERK5调节PC12细胞增殖或者分化的相关分子机制,为临床应用提供理论依据。目的通过分析比较ERK5过表达或者ERK5沉默的PC12细胞的增殖能力和细胞活性,确定ERK5对PC12增殖的影响。在ERK5过表达或沉默后,以及使用ERK5特异性抑制剂后不同情况下,使用NGF诱导PC12细胞分化,分析PC12细胞分化的结果,确定ERK5调节PC12细胞分化过程中涉及到的分化相关分子以及ERK5对PC12细胞分化的影响。确定ERK5激活的转录调节因子,拓展ERK5在NGF刺激后的信号通路。方法为提高转染效率,利用ERK5过表达、过表达空载体、沉默、沉默空载体的慢病毒感染PC12细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞,构建ERK5过表达、过表达对照、沉默、沉默对照的稳定细胞株,用于后续实验。细胞生长曲线的绘制和CCK-8吸光度值的测定用于分析PC12细胞的增殖情况。使用NGF诱导PC12细胞分化,通过Western Blot确定不同处理的PC12被诱导后,分化Marker的蛋白表达水平。使用Real-time PCR、显微镜观察等方法比较不同处理后的PC12的相关分化Marker在mRNA水平的变化,以及细胞形态的变化。使用GraphPad5.0对分化细胞所占比例进行计算,判断ERK5过表达或沉默后PC12细胞分化的差异。使用特异性抑制剂XMD8-92抑制ERK5活性,辅助验证ERK5活性被抑制的情况下,PC12的分化情况。利用Real-time PCR比较不同处理后的PC12细胞中ERK5下游转录调节因子mRNA表达量的变化,利用ChIP技术确定这些下游基因是否参与到ERK5信号通路。结果1.ERK5沉默的PC12细胞生长和增殖速度明显高于无处理组和空载体对照组的PC12细胞,ERK5过表达的细胞增长速度则与之相反。2.ERK5过表达的PC12细胞在NGF诱导后,随着时间的增加,分化Marker-GAP43蛋白表达量和mRNA含量有明显升高,而ERK5沉默的PC12细胞结果与之相反。通过显微镜拍照后的细胞图片中发现细胞突起明显,ERK5过表达的PC12细胞在NGF诱导第五天时,突起多而长,分支明显多于无处理组的PC12细胞,且GAP43蛋白表达分布于细胞质,且含量较高,而ERK5沉默的PC12细胞结果与之相反。通过Real-time PCR检测在NGF诱导后不同处理的PC12细胞在分化第0、1、3、5天时分化相关Marker的mRNA表达水平变化,随着时间增加,ERK5过表达组GAP43、NGFR、Nestin表达水平显著增加,而Tubb3的表达水平无统计学差异。不同组别比较,ERK5过表达组的GAP43、NGFR、Nestin的表达水平明显高于无处理组PC12细胞中的。XMD8-92处理的PC12细胞与溶剂对照组相比GAP43、NGFR的mRNA表达水平显著降低,Tubb3、Nestin的mRNA水平没有显著差异。3.在浓度为10μM时p-ERK5水平明显下降,在时间为2 h时p-ERK5水平明显下降。在最大浓度20μM和最长时间48 h时,p-ERK5的蛋白水平最低,此时XMD8-92的抑制效果最佳,且对时间和剂量有依赖性。4.ERK5过表达后的PC12细胞中CREB、FoxO3、P ml的mRNA水平明显高于无处理组的PC12细胞,而c-Jun、c-Myc、Twist1的mRNA水平明显低于无处理组PC12细胞中的。而ERK5沉默后的PC12细胞结果与之相反。5.ChIP结果显示p-ERK5抗体可以pull down下来c-Jun和P ml启动子区域的DNA片段。结论1.ERK5抑制PC12细胞增殖,促进PC12细胞分化。2.ERK5可能通过促进CREB、FOXO3、PML转录,抑制c-Jun、c-Myc、Twist1的转录,促进PC12细胞分化。且可能通过间接作用调节c-Jun、PML的转录。