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第一部分IL-17A在人深静脉血栓形成中对血小板的影响及机制目的:观察深静脉血栓(DVT)病人IL-17A的表达变化以及血小板聚集情况;研究IL-17A干预刺激正常人血小板后,对人血小板活化和聚集的影响;初步探讨IL-17A促人血小板活化和聚集的分子机制。方法:分离健康志愿者和DVT病人的血浆,采用ELISA的方法检测IL-17A等炎症因子的表达水平;分离健康志愿者和DVT病人的外周血血小板,采用血小板聚集实验检测器血小板聚集情况。分离健康志愿者外周血血小板进行体外刺激实验,分别用r IL-17A和r IL-17A+Cs A(线粒体通透性转换孔(MPTP)抑制剂)孵育血小板,而后采用ADP诱导其活化,从而将人血小板分为3组:1)ADP组;2)ADP+IL-17A组;3)ADP+IL-17A+Cs A组。利用流式细胞术检测血小板线粒体膜电位情况和血小板活化标志CD62p、PAC-1的表达情况;血小板聚集实验检测血小板聚集情况;利用Western Blot的方法检测血小板活化信号通路蛋白的表达水平,即检测P-ERK2和p53蛋白的变化。结果:DVT病人血浆中IL-17A等指标表达水平明显升高;DVT病人血小板聚集水平明显增高。在健康志愿者外周血血小板中,与ADP组相比,ADP+IL-17A组血小板线粒体膜电位降低,活化标志CD62p、PAC-1表达明显升高,而给予抑制剂Cs A后,相较于ADP+r IL-17A组,血小板线粒体膜电位升高,活化标志CD62p、PAC-1表达下降。此外,与ADP组相比,ADP+r IL-17A组血小板聚集明显增多,而ADP+IL-17A+Cs A组血小板聚集显著低于ADP+r IL-17A组。而在信号蛋白检测中,ADP+IL-17A组中P-ERK2和p53的表达高于其在ADP组中的表达,而CSA抑制IL-17A的这种促进表达作用,即抑制了血小板活化信号通路蛋白的表达。结论:在DVT病人中,IL-17A在血浆中的表达水平上调,血小板聚集水平升高。在体外血小板检测中,IL-17A在DVT中能够通过激活ERK2/p53信号通路,调节血小板中MPTP的开放,促进血小板活化和聚集,从而发挥促进DVT形成的作用。第二部分IL-17A在小鼠深静脉血栓形成中对血小板功能的影响及机制目的:建立小鼠DVT模型,研究IL-17A在小鼠DVT中的表达变化;观察给予IL-17A以及中和IL-17A对小鼠DVT的影响;给予小鼠体内IL-17A干预,观察干预后对小鼠血小板活化的影响,并探讨IL-17A促进血小板活化的分子机制。方法:通过缩窄下腔静脉构建小鼠DVT模型,检测手术后小鼠血浆中IL-17A的水平。然后将Balb/c小鼠进行DVT手术,术前尾静脉给予PBS或者PBS溶解的r IL-17A,分别观察手术后不同时间点(2h,3h,6h,12h,24h,48h)IL-17A对深静脉血栓的影响,确定差异最大的时间点。根据确定的时间点再次构建小鼠DVT模型,随机将Balb/c小鼠分为5组:1)对照组(Control组);2)假手术组(Sham组)3)DVT组(术前10min尾静脉注射等量的PBS,后进行DVT手术);4)r IL-17A组(术前10min尾静脉注射等量的溶解有r IL-17A(50μg/kg)的PBS,后进行DVT手术);5)Anti-IL-17A组(术前10min尾静脉注射等量的溶解有IL-17A单抗(5 mg/kg)的PBS,后进行DVT手术)。术后24h采用摘眼球取血法处死小鼠获取血小板。对于血小板,利用流式细胞术检测小鼠外周血血小板活化标志CD61、CD49β的表达情况;血小板聚集实验检测血小板聚集情况;利用Western Blot的方法检测血小板活化信号通路蛋白P-ERK2和p53表达水平。结果:在DVT造模小鼠血浆中IL-17A水平显著升高。在血栓动态检测中,r IL-17A对深静脉血栓影响最大的时间点在术后24h。而在24h时间点进一步检测显示:与DVT组相比,r IL-17A组血栓长度和重量都增高,而Anti-IL-17A组小鼠血栓长度和重量均降低。与DVT组相比,r IL-17A促进了血小板活化标志CD61、CD49β的表达,促进血小板的聚集,表现为黏附聚集增强,而中和IL-17A则使血小板的活化标志CD61、CD49β表达降低和聚集减弱。但是以上三组的指标仍均高于Control和Sham组。而在信号通路中,r IL-17A组中P-ERK2和p53的表达比在DVT组中的表达高,而在Anti-IL-17A组中血小板活化信号通路蛋白P-ERK2和p53的表达比DVT组低。结论:在小鼠DVT模型中,IL-17A在血浆中的表达水平上调。造模后,IL-17A能够通过激活P-ERK2和p53蛋白信号通路,促进血小板活化和聚集,从而发挥促进DVT形成的作用。而中和IL-17A后,P-ERK2和p53蛋白表达下调,血小板的活化和聚集降低,从而抑制了DVT的形成。第三部分IL-17A在深静脉血栓形成时对中性粒细胞浸润和内皮细胞活化的作用及机制背景:通过建立小鼠DVT模型,给予IL-17A以及抗体中和IL-17A,观察干预后对小鼠血栓中中性粒细胞和静脉血管内皮细胞的影响,并探讨IL-17A促进二者变化的分子机制。方法:将Balb/c小鼠随机分为5组:1)对照组(Control组);2)假手术组(Sham组);3)DVT组(术前10min尾静脉注射等量的PBS,进行DVT手术);4)r IL-17A组(术前10min尾静脉注射等量的溶解有r IL-17A(50μg/kg)的PBS,后进行DVT手术);5)Anti-IL-17A组(术前10min尾静脉注射等量的溶解有IL-17A单抗(5mg/kg)的PBS,后进行DVT手术)。对于中性粒细胞,利用免疫组化的方法检测血栓中中性粒细胞浸润情况和用ELISA方法检测小鼠血浆中MIP-2的表达;采用免疫荧光的方法检测血栓中瓜氨酸的组蛋白H3(Cit H3)的分泌形成情况,用胞外DNA测定检测血浆中DNA含量,利用Western Blot的方法检测中性粒细胞活化信号通路蛋白p38的表达水平。对于下腔静脉,用免疫组化的方法和实时定量PCR检测内皮细胞的活化标志血管细胞间黏附分子-1(VCAM-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达情况;利用Western Blot的方法检测内皮细胞活化信号通路蛋白p38的表达水平。结果:在形成的血栓中,与DVT组相比,r IL-17A促进了中性粒细胞的浸润,而应用IL-17A单抗组中中性粒细胞浸润减少。此外,与DVT组相比,r IL-17A组中中性粒细胞胞外环(NETs)的组成成分Cit H3和血浆中的DNA也显著增高,而中和IL-17A后,二者的表达均降低。与DVT组相比,r IL-17A组血浆中MIP-2的表达增高,而中和IL-17A后,MIP-2的表达水平降低。同时,在r IL-17A组中信号蛋白p38表达高于DVT组,而Anti-17A组中p38的表达水平低于r IL-17A组。在静脉血管中,内皮细胞活化标志VCAM-1和ICAM-1在r IL-17A组中的表达高于DVT组,在Anti-IL-17A组中的表达低于DVT组和r IL-17A组,而在Control和Sham组中几乎无表达。而在信号蛋白检测中,r IL-17A组p38的表达高于其在DVT组中的表达,而IL-17A单抗抑制IL-17A的这种促进表达的作用。结论:IL-17A能明显促进血栓中中性粒细胞的浸润及NETs的形成,从而促进DVT的的形成。IL-17A能上调内皮细胞中p38的表达,促进内皮细胞的活化,从而发挥促进DVT形成的作用。