众所周知人体通过环境中空气、水和食物等介质经常要接触一些有害物质，包括各种潜在致癌或致突变物，例如电离辐射、传染因子和微生物毒素等，长期接触这类致癌物就有可能导致癌症的发生，所以癌症的发生在很大程度上受到环境因素的影响。但是，在接触相同环境的不同个体之间癌症发生的情况又不尽相同，这又与个体的遗传因素有关，因此癌症是机体遗传因素和外界环境因素相互作用的结果，系一种环境相关疾病。然而，在环境因素的作用下，机体的遗传因素会发生改变，比如遗传不稳定性的增加，而癌症发生的一个非常重要的原因就是遗传信息发生较大改变或者是遗传不稳定性增加。因此，对机体遗传不稳定性的研究在环境相关疾病—癌症的研究中就显得非常重要。遗传不稳定性是指可引起一系列能导致总遗传物质发生改变的突变事件的发生率增加的一种短暂或持久的状态，它包括基因水平的核苷酸改变和染色体水平的基因组不稳定性。遗传不稳定性可自发产生，也可由外来物质(比如辐射)暴露所致。电离辐射引起的遗传不稳定性不仅可以影响正常细胞和肿瘤细胞对辐射的反应，也可以影响癌症的发生。电离辐射引起的遗传不稳定性也反映了机体对辐射的敏感性。机体辐射敏感性的研究具有实用意义，如果能在治疗前对癌症患者的辐射敏感性进行预测，这将有助于临床医师制定个体化的治疗计划，有利于提高癌症治疗效率和降低副反应。维持基因组完整性的主要机制包括两类：(a)DNA复制过程中的高保真机制，这包括保持基因和基因组完整的DNA修复途径和染色体基因外修饰途径；(b)维持有丝分裂的稳定性和染色体的完整性。细胞周期调控在细胞维持基因组完整性中起重要作用，ATM蛋白是一个细胞周期调控蛋白，它可以调节细胞周期、DNA修复和凋亡等过程。当DNA损伤产生后，ATM参与细胞周期调控过程，阻滞细胞分裂以提供足够的时间进行损伤修复。同时ATM激酶会启动一系列的信号转导途径，激活DNA修复和凋亡等过程，从而使损伤得以修复和基因组完整性得以保持。虽然，DNA连接酶只是参与DNA修复的最后步骤—DNA连接，但它们是DNA修复途径以及DNA重组过程中不可缺少的酶，而且在维持基因组完整性中起非常重要的作用。XPF蛋白不仅是核苷酸切除修复途径中切开DNA受损双链过程所需的核酸内切酶之一，而且也是DNA链之间交联的重组修复以及同源重组修复等过程不可缺少的酶。因此，以上这些蛋白都在DNA修复过程起重要作用，在维持机体基因组稳定性中不可缺少。本论文主要用彗星试验和微核试验检测肺癌和乳腺癌患者遗传损伤的背景值和由辐射引起的遗传损伤，来评价肺癌和乳腺癌患者的遗传不稳定性，并观察这两种癌症患者在遗传稳定性上的个体差异。同时还用western blotting试验检测肺癌和乳腺癌患者ATM、DNA连接酶Ⅲ、DNA连接酶Ⅳ和XPF四个蛋白的表达水平。然后分析肺癌和乳腺癌患者遗传不稳定性与四个DNA修复相关蛋白表达水平之间的关系。本研究分两个阶段完成：第一阶段：用彗星试验、微核试验和hpry基因突变试验检测放疗期间癌症患者的遗传损伤，其目的是评价这三个试验在检测遗传不稳定性中的灵敏度，并观察癌症患者对放疗反应的个体差异。第二阶段：肺癌和乳腺癌患者遗传不稳定性和DNA修复相关蛋白表达的研究。第一部分用彗星试验、微核试验和hprt基因突变试验检测放疗期间癌症患者的遗传损伤研究自发的以及辐射引起的遗传不稳定性的方法很多，但是克隆存活试验和染色体畸变试验等由于自身的局限性不适合大样本研究。本研究希望通过监测放疗患者的遗传损伤来确定能快速简便地用于检测自发的以及辐射引起的遗传不稳定性的方法。放疗已被广泛用于癌症的治疗，近来在癌症放疗中取得的进展有利于改善癌症患者治疗的预后。但放疗射线在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常细胞造成伤害，从而导致DNA损伤甚至继发肿瘤。对接受放疗后机体产生的生物学效应进行监测可以评价射线对机体产生的损伤。本研究选择了患有不同癌症的患者24例，对照23例。病例组和对照组在年龄、性别和吸烟等方面均无显著性差异(P＞0.05)。在癌症患者接受放疗前和放疗累积剂量达到10、30和50Gy时采集新鲜外周血，对照组仅采血一次。取1ml外周血分离淋巴细胞用于彗星试验，其余血样分别进行培养用于微核试验和hprt基因突变试验，最后分析癌症患者和对照组遗传损伤背景值是否存在差异，并分析放疗累积剂量和遗传损伤之间的剂量—效应关系。研究结果显示放疗前癌症患者的平均微核细胞率(MCF)和微核率(MNF)分别为11.29±1.22‰和12.46±1.36‰，而对照组的平均MCF和MNF分别为5.96±0.70‰和6.65±0.82‰，经统计分析，放疗前癌症患者的平均MCF和MNF均明显高于对照组(P＜0.01)。但是，彗星试验的结果显示放疗前癌症患者和对照组的平均尾长(MTL)和平均尾相(MTM)的差异不明显(P＞0.05)，hprt基因突变试验的结果亦显示对照组和病例组之间hprt基因平均突变率(Mf-hprt)无显著性差异(P＞0.05)。癌症患者放疗期间的遗传损伤均随着放疗剂量的增加而增加。在微核试验中，当放疗剂量分别达到10、30和50Gy时平均MCF分别为31.25、53.63和67.28‰，平均MNF分别为35.83、64.63和85.00‰，两者均分别高于0Gy时相应的值(11.29‰和12.46‰，P＜0.01)，而且各剂量组之间也存在显著性差异(P＜0.01)，同时，癌症患者淋巴细胞核分裂指数也随着放疗累积剂量的增加而降低。在彗星试验中，当放疗剂量分别达10、30和50Gy时癌症患者MTL和MTM分别为1.96、2.26和2.63μm以及0.43，0.56和0.70，两者均分别高于0Gy时相应的值(1.77μm和0.70，P＜0.01)，而且各剂量组之间也存在显著性差异(P＜0.01)。我们在hprt基因突变试验中也得到了类似的结果，在放疗剂量为10、30和50Gy时癌症患者的平均Mf-hprt分别为0.91，1.07和1.15‰，均明显(P＜0.01)高于0Gy时的值(0.82‰)，不同剂量组之间也存在显著性差异(P＜0.01)。本研究结果发现：放疗前癌症患者染色体损伤背景值要高于对照组，并且放疗期间癌症患者的遗传损伤随着放疗剂量的增加而增加，癌症患者对放疗所诱发的遗传损伤存在较大的个体差异。本研究还发现彗星试验、微核试验和hprt基因突变试验均可用于检测放疗引起的遗传损伤，但是hprt基因突变试验的灵敏度不如彗星试验和微核试验高。第二部分肺癌和乳腺癌患者的遗传不稳定性以及四个DNA修复相关蛋白表达在第一部分实验中，放疗前癌症患者的遗传损伤在不同试验中结果有差异，其原因可能是样本量比较小以及肿瘤类型较多。因此应该选择单一肿瘤并扩大样本量进行研究。另外，正如其它文献的报道那样，我们发现不同癌症患者对放疗的反应差异很大。因此，如果在放疗前对癌症患者的放射敏感性进行测定，那么，不仅可以提高癌症患者的治疗效率，而且可以同时有效降低放疗的副反应。维持遗传不稳定性的主要机制是机体的DNA修复机制，因此，与DNA修复相关的细胞周期调控蛋白、DNA连接酶和参与多种修复途径的XPF蛋白可能与癌症患者的遗传不稳定性之间存在一定的联系。为此本研究选择了45例肺癌患者和39例对照(两组人群在年龄、性别、吸烟和饮酒等方面均无显著性差异)，48例乳腺癌患者和相应的对照33例(两组人群在年龄、性别、吸烟和饮酒等方面均无显著性差异)。癌症患者均为新确诊，在未接受治疗之前抽取肝素抗凝静脉血10ml，取4ml血样用于遗传不稳定性研究，其中2ml立即接受3Gy辐射，然后用彗星试验和微核试验分别检测辐射前后的遗传损伤，其余6ml血样用梯度离心法分离淋巴细胞后提取蛋白质，然后用western blotting测定ATM、DNA连接酶Ⅲ、DNA连接酶Ⅳ和XPF四个蛋白的表达水平。遗传不稳定性检测结果显示，在微核试验中，肺癌患者辐射前的平均MCF和MNF分别为9.84‰和10.72‰，均明显高于对照组相应的值(5.87‰和6.31‰，P＜0.01)，由辐射引起的平均MCF和MNF分别为74.16‰和84.64‰，也同样高于对照组(61.33‰和68.92‰，P＜0.01)。在彗星试验中，肺癌患者辐射前MTL和MTM分别为1.69μm和0.80，明显高于对照组(1.50μm和0.61，P＜0.05)，由辐射引起的MTL和MTM分别为1.46μm和0.96，也分别明显高于对照组(1.05μm和0.65，P＜0.05)。乳腺癌患者遗传不稳定性的检测结果和肺癌患者类似，微核试验和彗星试验的结果均显示乳腺癌患者自发的和由辐射引起的遗传不稳定性均明显高于对照组。我们以对照组辐射引起遗传损伤的百分之九十的百分位数作为分界点将癌症患者分为辐射敏感组和辐射不敏感组。结果显示微核试验对辐射敏感人群的检测具有较高的灵敏度，但是两个试验在检测辐射敏感人群时存在差异，同一患者用不同的试验进行检测可以得到不同的结果。在同一试验中彗星试验的两个指标之间差异较大，而微核试验中的两个指标之间的一致性较高。因此，我们的研究结果提示微核试验可能是较好的用于治疗前癌症患者辐射敏感性测定的方法，但为了较为全面地评价癌症患者的辐射敏感性应该同时使用多种方法。DNA修复相关蛋白表达结果显示，与对照组相比，癌症患者四个蛋白的表达均有不同程度的下降，但肺癌患者的ATM、DNA连接酶Ⅲ和XPF三个蛋白平均表达水平分别为0.79、0.72和0.72，明显低于对照组(1.18、0.96和0.99)(P＜0.01)，而乳腺癌患者的ATM、DNA连接酶Ⅲ、DNA连接酶Ⅳ和XPF四个蛋白平均表达水平(0.73、0.57、0.71和0.81)均分别明显低于对照组(1.38、0.98、0.95和1.03，P＜0.01)。相关性分析结果显示，彗星试验中的尾长和尾相之间以及微核试验中的微核细胞率和微核率之间均有较好的相关性。尾相测定的结果发现肺癌和乳腺癌患者的遗传损伤背景值与辐射引起的遗传损伤之间均存在较好的相关性。DNA修复相关蛋白表达水平和遗传不稳定性之间的相关性分析发现，在肺癌患者中，ATM蛋白表达水平与尾相测定的遗传损伤背景值以及尾长和尾相测定的辐射引起的遗传损伤之间均有较好的相关性。DNA连接酶Ⅳ蛋白表达水平与尾长测定的遗传损伤背景值以及尾相测定的辐射引起的遗传损伤之间均有一定相关性，XPF蛋白表达水平与尾长和尾相测定的辐射引起的遗传损伤的之间有较好的相关性。在乳腺癌患者中，DNA连接酶Ⅳ蛋白表达水平与尾长测定的遗传损伤背景值以及尾相测定的辐射引起遗传损伤之间均有较好相关性。另外，我们还分析了性别、吸烟和癌症分期等情况对癌症患者遗传不稳定性及DNA修复相关蛋白表达的影响，结果发现吸烟组肺癌患者ATM蛋白表达水平明显低于不吸烟组，Ⅰ期乳腺癌患者DNA连接酶Ⅲ的表达水平均明显高于其余两组，但是Ⅱ、Ⅲ两期乳腺癌患者的DNA连接酶Ⅲ的表达水平无显著性差异。结论1．癌症患者在放疗期间所产生的淋巴细胞遗传损伤随着累积放疗剂量的增加而增加，并呈一定的剂量效应关系。癌症患者对放疗的反应存在较大的个体差异。2．肺癌和乳腺癌患者自发的和由辐射引起的遗传不稳定性均明显高于对照组。肺癌和乳腺癌患者淋巴细胞对辐射的敏感性存在较大的个体差异。3．彗星试验和微核试验是两种快速、简便、有效的检测癌症患者淋巴细胞自发的以及由辐射引起的遗传不稳定性的方法。这两个方法均可用于癌症患者放疗前淋巴细胞放射敏感性的测定，可为癌症患者治疗方案的制定提供依据。4．无论肺癌或乳腺癌患者，和对照组相比，四个DNA修复相关蛋白表达均有不同程度的下降，但肺癌患者ATM、DNA连接酶Ⅲ和XPF三个DNA修复相关蛋白表达水平与对照组有明显差异；而乳腺癌患者ATM、DNA连接酶Ⅲ、DNA连接酶Ⅳ和XPF四个DNA修复相关蛋白表达水平与对照组有明显差异。因此，同一蛋白的表达水平在不同的癌症患者中可能有差异。5．癌症患者DNA修复相关蛋白表达水平的降低可能与其遗传不稳定性的升高之间有一定的相关性，在本研究中也发现了一些相关性，但是由于遗传不稳定性的升高是一个受多方面因素影响的结果，而且与DNA修复相关的蛋白种类很多，所以很可能单个蛋白表达的降低或升高在不同种类的肿瘤或不同的个体有一定的差异。今后的应当同时研究多种细胞周期调控蛋白和与DNA修复相关的蛋白。