植物体细胞杂交技术具有不可比拟的优越性，它可以克服有性杂交不亲和障碍，将不同亲缘关系(包括近缘和远缘)植物的基因组进行融合，以拓宽对野生基因资源的利用；可同时转移细胞核和细胞质基因，使双亲胞质基因和核基因在杂种细胞中共存或重组，从而产生多种多样的，有性杂交无法实现的作物新类型：可转移多基因编码的性状(如作物的产量、品质、抗逆)等，近年来在近缘体细胞杂交方面取得了诸多进展，得到了多种可育杂种后代，并应用于生产实践中，然而远缘体细胞杂交却因为难以再生这一瓶颈的限制而少有研究。远缘体细胞杂交中的核质基因组组成及相互关系、体细胞杂种细胞系代谢及基因表达的整合更是鲜有报道。本论文通过对单子叶植物高羊茅与小麦以及双子叶植物柴胡与麻花艽的不对称体细胞杂种的核质基因组研究，并以原生质体培养以及自融合为对照，了解远缘体细胞杂交的核／质组成及互作方式以及原生质体在培养过程中发生的体细胞无性系变异与体细胞杂种性状的关系。另外通过对中药材柴胡与麻花艽体细胞杂种细胞系代谢产物以及基因表达情况的分析，初步研究体细胞杂交过程中双亲的基因表达及代谢途径的拮抗与整合作用。为远缘体细胞杂交在牧草育种和中药材生物技术及代谢组研究中的应用提供理论基础。1．单／双子叶植物远缘体细胞杂交的比较研究1)．高羊茅与小麦远缘不对称体细胞杂种的核／质基因组本实验以高羊茅为受体，与经380uW／cm~2的UV照射30s、1min、1.5min、2min、3min的小麦原生质体经PEG介导进行融合，同时以高羊茅的原生质体培养作为对照。分别经过40天的暗培养，获得大量的体细胞杂种细胞系及亲本细胞系。小麦亲本原生质体培养细胞系的情况在本实验室的前期研究中已有报道(Xiang et al.,2003,2004,Cheng et al.,2004)，以下仅描述杂种及高羊茅原生质体培养及分析的结果。形态学分析表明，不同细胞系具有不同的表型，多数来源于UV照射30s及1min的细胞系生长旺盛，愈伤组织表型偏向于高羊茅，约25％的细胞系可高效再生出表型偏向于高羊茅的绿色植株：而来源于UV照射1.5min或更高剂量的组合则仅形成生长缓慢、不具有再生能力的细胞系或不能分裂，对照高羊茅原生质体产生的细胞系生长旺盛，表型与其来源的亲本培养物相近。对于部分生长旺盛的细胞系进行同工酶分析表明，杂种的生化标记以高羊茅的谱带为主，同时具有小麦特征带及新带，而原生质体培养细胞系则基本与亲本高羊茅谱带一致，仅少数细胞系具有新带或缺少部分高羊茅的特征带。RAPD分析表明，杂种细胞系具有双亲的特征带和新带，对照细胞系则具有与高羊茅几乎完全相同的谱带。染色体分析显示，杂种细胞系的染色体形态偏近于高羊茅，但可再生细胞系的染色体数目为26-45条，而不具再生能力细胞系含有45-84条染色体：对照细胞系染色体分布范围为22-52条，所有的细胞系都具有1-3个小染色体或染色体片段以及1-2条双／多着丝粒染色体。GISH分析显示，杂种细胞系中没有完整的小麦染色体，可见到2-4个小麦染色体片段以易位的形式存在于高羊茅染色体上。应用RFLP，SSR研究杂种细胞系胞质基因组。杂种细胞系胞质基因组整体上偏向受体，但同时具有供体特征带及新带。表明双亲的胞质基因组也进行了复杂的重组过程，但重组仅涉及胞质基因组的部分位点，而另一部分位点则表现为与高羊茅一致。对照细胞系胞质基因组的分析显示，其组成与亲本相似，仅在少数细胞系的少数位点上发生变异。杂种细胞系及对照甲基化变异的MSAP分析显示，杂种总体的甲基化程度与受体高羊茅相近，但是有大量位点发生甲基化变异，不同细胞系变异的位点不同；而亲本原生质体细胞系的甲基化及变异则表现出高度的同一性。2)．狭叶柴胡与高寒藏药的体细胞杂交及杂种的核／质基因组本实验以狭叶柴胡原生质体为受体，与经UV照射30s、1min、1.5min、2min的麻花艽原生质体经PEG介导进行融合，同时以狭叶柴胡的原生质体培养以及自融合作为对照。分别经过70天的暗培养，获得大量的体细胞杂种细胞系及亲本狭叶柴胡原生质体培养以及自融合细胞系。亲本麻花艽的原生质体不能分裂。形态学分析显示，杂种细胞系以及自培养细胞系表型均偏近于狭叶柴胡，且部分杂种细胞系以及自融合细胞系可以分化出绿色的不定芽及不定根。同工酶分析显示，杂种细胞系含有以受体为主的同工酶谱带，同时具有供体特征带以及新带。RAPD及5sDNA分析从分子水平证实了杂种细胞系供／受体基因组的共存与重组。染色体分析显示，杂种细胞系与受体相同，具有9-14条狭叶柴胡的染色体，而狭叶柴胡原生质体培养细胞系与自融合细胞系分别具有12条以及20-24条染色体，显示出狭叶柴胡细胞系在体细胞杂交以及自培养过程中的遗传稳定性。胞质基因组的RFLP分析显示，杂种细胞系的线粒体基因组谱带以狭叶柴胡特征带为主，同时具有少量供体特征带及新带，而叶绿体的组成则与狭叶柴胡完全相同。表明了线粒体在部分位点发生重组，而叶绿体则表现为不等分离。通过以上两个实验，我们对远缘体细胞杂交有如下认识：在单子叶植物及双子叶植物远缘杂交过程中，受／供体均存在再生互补现象。高羊茅／小麦和狭叶柴胡／麻花艽通过受体(+)供体的双亲细胞的遗传物质互补效应而再生植株。此外，受体的自融合中也有多个再生细胞系可以分化出绿色植株，表明这种再生互补效应不仅发生在不同物种之间，而且可以由同一物种的生长状态不同的细胞系之间或同一细胞系中具有不同遗传组成的细胞之间实现再生互补。本研究表明，遗传平衡也是杂种细胞系具有再生能力的重要条件之一，但本实验中部分具有相对平衡遗传物质的亲本原生质体却不能再生植株。由此推断，遗传平衡与双亲遗传物质的互补共同控制着杂种细胞系的再生能力。在以上两组合之中，体细胞杂种细胞系供体胞质基因的多态性在低UV辐照剂量范围中差别不大，新带比例变化亦不明显，表明UV照射在剂量30s-1min范围内对供体胞质基因的整合及重组没有明显的剂量效应，因此单子叶植物与双子叶植物中对于UV的响应具有相似的性质。2．狭叶柴胡与麻花艽体细胞杂种细胞系的代谢、转录组研究麻花艽的主要药效成分是龙胆苦甙、獐牙菜苦甙和齐墩果酸。目标代谢产物分析显示，所有的杂种细胞系中均不含有龙胆苦甙，一些体细胞杂种中含有獐牙菜苦甙，含量少于0.03130mg／g干重，低于麻花艽中的含量。而双亲均具有的成份齐墩果酸的含量呈现复杂的变化，部分杂种细胞系中只有痕量的齐墩果酸，部分杂种细胞系含量低于柴胡，但也有含量高于供体麻花艽的细胞系(可达1.729mg／g干重)。杂种细胞系No．3Q，No．3Q1’的醇溶性物质代谢图谱分析显示，两个杂种细胞系具有较多与亲本狭叶柴胡相同的代谢产物，含量分别占56.23％和38.84％；而所具有的供体特有成分含量为24.39％和36.30％；新物质的含量分别为17.91％和24.86％。另一方面，体细胞杂种细胞系中的糖类代谢物分别为32.25％和14.32％，远高于双亲中糖类物质的含量(柴胡为3.62％，麻花艽为2.39％)，从而表现出体细胞杂种细胞系中基础代谢的加强，这可能是由于双亲中复杂次生代谢途径的相互拮抗减弱而引起的。DDRT转化的转录组研究显示，与受体狭叶柴胡相比3Q和3Q1’中新表达的片段分别占13.59％和11.57％，沉默的片段分别占10.40％和10.35％。选取部分差异片段进行测序比对。结果为：约45.5％的片段的比对结果为无明显相似的片段。有比对信息的片段中，约41.7％片段为hypothetical protein。体细胞杂种细胞系中的差异片段主要是一些与基础代谢以及基本的生化过程相关的片段，反映出体细胞杂种细胞系中基础代谢的加强。单个基因-beta-amyrin在体细胞杂种细胞系及双亲中的表达分析发现：亲本狭叶柴胡及麻花艽中分别表达1个和2个beta-amyrin基因，而3Q及3Q1’中则表达来源于供体麻花艽的beta-amyrin基因。