第一部分 DSF@PEG-HCuSNPs的制备、表征及性能检测目的 制备DSF@PEG-HCuSNPs并检测其基本理化性质、光热性能及生物降解性。方法 以Cu2O纳米球为模板,通过硫化反应合成HCuSNPs载体,利用静电吸附作用在其表面修饰NH2-PEG2000并将双硫仑（Tetraethylthiuram disulfide,DSF）装载于 HCuSNPs 的中空介孔结构中制备DSF@PEG-HCuSNPs。利用透射电子显微镜、扫描电子显微镜、马尔文粒径仪、X射线光电子能谱仪、X射线衍射仪、比表面积及孔径分析仪、热重分析仪、傅里叶变换红外光谱仪和紫外分光光度计对纳米粒的基本理化性质进行检测,包括形态结构、元素组成、粒径、电位、Cu及S元素价态、紫外吸收光谱、载药量等性能。采用808及1064 nm激光仪在第一及第二近红外生物窗口下检测纳米粒在不同浓度及不同功率辐照下的光热性能。在1064nm激光的辐照下,使用ICP-OES检测PEG-HCuSNPs在pH值为6.5和7.4的模拟体液中Cu2+的累积释放量,并取pH为6.5和7.4的模拟体液中的PEG-HCuSNPs通过透射电子显微镜观察其降解情况。结果 透射电子显微镜和扫描电子显微镜可见HCuSNPs呈具有中空结构的大小均一的球形结构,其尺寸约为220 nm,其透射电镜元素映射分析说明了 Cu和S元素在HCuSNPs框架中的均匀分布。通过动态光散射（DLS）测量,确定了 HCuSNPs的流体力学平均粒径为240.6 nm,这与TEM和SEM结果相符。HCuSNPs的X射线衍射图谱显示其特征峰与六方硫化铜晶体对应。X射线光电子能谱分析了Cu和S的化学价态,其中Cu的结合能中心分别与Cu 2p3/2和Cu 2p1/2的XPS峰对应,S的结合能中心S 2p3/2和S 2p1/2分别表明了硫化物和二硫化物的存在。N2吸附-脱附等温线和孔径分布分析显示HCuSNPs具有较高的比表面积和均匀的孔径,分别为285.5 m2 g-1和5.4 nm。以上结果均证明了 HCuSNPs的成功制备。在 HCuSNPs 表面修饰 NH2-PEG2000（PEG-HCuSNPs）和携载 DSF（DSF@PEG-HCuSNPs）后,纳米粒的流体力学平均粒径分别为262.0和263.7 nm。另外,HCuSNPs,PEG-HCuSNPs和DSF@PEG-HCuSNPs的电位结果分别为-14.4±0.82、4.64±0.70和-1.67±0.26mV,分别归因于NH2-PEG2000的表面改性和 DSF 的装载。PEG-HCuSNPs 和 DSF@PEG-HCuSNPs的傅里叶变换红外光谱分析显示DSF@PEG-HCuSNPs表现出了 DSF的特征峰,验证了 DSF的成功装载。除此以外,HCuSNPs、PEG-HCuSNPs和DSF@PEG-HCuSNPs的热重分析结果进一步确认了NH2-PEG2000的有效改性和DSF的成功装载,并根据结果计算出NH2-PEG2000的改性量和DSF的载药量分别为6.72%和40.15%。通过紫外分光光度计对HCuSNPs,PEG-HCuSNPs和DSF@PEG-HCuSNPs的吸光度测量显示三者均在1064 nm处有明显吸收且随着HCuSNPs的浓度增加而升高,从而证明了 DSF@PEG-HCuSNPs作为光热转换剂的应用潜力。给予DSF@PEG-HCuSNPs以1064nm激光辐照后可见温度上升与纳米粒的浓度、激光功率和辐照时间相关,表现出了显著的光热转换效率（23.8%）。同时,在808 nm激光的辐照下,DSF@PEG-HCuSNPs也检测到较好的光热性能。将PEG-HCuSNPs溶解于不同pH值的模拟体液中,在NIR-Ⅱ激光辐照后,通过ICP-OES)和TEM分析PEG-HCuSNPs的降解行为,可见无论是在酸性还是中性条件下,激光辐照后Cu2+的累积释放量都显著增加,而在无激光辐照的情况下,PEG-HCuSNPs在中性SBF溶液中放置96小时后其纳米结构基本保持完整。结论制备的HCuSNPs纳米载体的形态呈球形,大小均一,分散性好,在其表面成功地修饰了 PEG并在其中空结构中有效地负载了DSF,即 DSF@PEG-HCuSNPs。DSF@PEG-HCuSNPs 在促进 NIR-Ⅱ 激光转化为热能方面的表现出色,并且近红外激光的辐照可加速其在肿瘤组织中的降解,为在TME作用下促进细胞毒性Cu（DTC）2的形成奠定了一定的基础。第二部分 DSF@PEG-HCuSNPs的生物分布及光声成像研究目的观察DSF@PEG-HCuSNPs的体外及裸鼠乳腺癌皮下移植瘤模型内光声成像（Photoacoustic imaging,PAI）的效果并评价其成像能力;研究DSF@PEG-HCuSNPs通过EPR效应被动聚集到肿瘤组织内的效果。方法根据Cu的浓度将DSF@PEG-HCuSNPs配置成浓度为100、200、400、600和800 μg·mL-1的水溶液,建立凝胶模型并在光声成像系统下采集纳米粒的光声成像图及光声信号值,分析纳米粒体外成像的最佳浓度。收集对数期生长的4T1乳腺癌细胞注射入裸鼠皮下建立乳腺癌皮下移植瘤模型,待肿瘤生长至一定体积后进行体内光声成像实验。经尾静脉将DSF@PEG-HCuSNPs注射至荷瘤裸鼠体内,在不同时间点（0、1、2、4、8、12和24小时）采集荷瘤裸鼠肿瘤部位的光声成像图并对肿瘤内的光声信号值进行定量分析。建立雌性裸鼠4T1乳腺癌皮下移植瘤模型,待肿瘤生长至一定体积后进行DSF@PEG-HCuSNPs的生物分布实验。经尾静脉将纳米粒注射至荷瘤裸鼠体内,在不同的时间间隔（4、8和24小时）切除主要器官和肿瘤,采用ICP-OES法测定器官和肿瘤中Cu的含量。结果DSF@PEG-HCuSNPs在体外PA成像中表现出良好的对比增强,其PA信号在100至800 μg·mL-1的浓度范围内随浓度的增加呈线性增强;荷瘤裸鼠肿瘤内的PA信号呈时间依赖性增强,经尾静脉注射后24小时达到峰值。由于静脉注射后典型的EPR效应,DSF@PEG-HCuSNPs被动地聚集到肿瘤组织中,在注射后24小时,其在肿瘤组织中的含量可达约5.2%。结论 DSF@PEG-HCuSNPs具有良好的光声成像特性,可以通过EPR效应有效抵达肿瘤组织内,显示了其作为光声成像造影剂在乳腺癌诊疗领域的应用具有广阔的前景。第三部分 DSF@PEG-HCuSNPs的NIR-Ⅱ光热协同/增效DSF化疗的疗效评价目的 评估DSF@PEG-HCuSNPs的生物相容性;研究DSF@PEG-HCuSNPs体内外热疗协同/增效DSF化疗的效果及作用机制。方法 将乳腺癌4T1细胞分别与不同剂量的DSF（12.5、25、50、100 和 200 μg·mL-1）、PEG-HCuSNPs（12.5、25、50、100 和 200μg·mL-1）和 DSF@PEG-HCuSNPs（12.5、25、50、100 和 200 μg·mL-1）共孵育12、24和48小时后,采用CCK-8法检测并计算细胞生存率。采用1064nm 激光辐照与 PEG-HCuSNPs、DSF@PEG-HCuSNPs 共孵育后的乳腺癌4T1细胞,通过CCK-8法、流式细胞分选术及激光共聚焦显微镜定性及定量分析单纯光热治疗以及热疗协同/增效DSF化疗对乳腺癌4T1细胞的治疗作用。选取雌性裸鼠和雌性昆明鼠各25只进行体内生物安全性评估,经尾静脉注射DSF@PEG-HCuSNPs的PBS缓冲溶液（20 mg·kg-1）。分别于注射DSF@PEG-HCuSNPs后0、1、7、14和28天采集血液及主要器官（心、肝、脾、肺、肾）,进行血常规检查、血清生化分析及H＆E染色组织学分析。在雌性裸鼠右侧背部建立4T1乳腺癌皮下移植瘤模型,待肿瘤大小增长至50-80 mm3时,将4T1荷瘤雌性裸鼠按照随机分配的原则分为7组:（1）对照组（注射PBS缓冲液）,（2）单纯激光辐照组,（3）DSF 化疗组,（4）PEG-HCuSNPs 组,（5）DSF@PEG-HCuSNPs 组,（6）PEG-HCuSNPs+激光组,（7）DSF@PEG-HCuSNPs+激光组。其中,（2）、（6）和（7）组在尾静脉注射之后使用1064nm激光以功率1.5 W·cm-2辐照肿瘤部位10分钟,通过红外热成像仪监控并记录激光辐照过程中肿瘤部位的温度变化情况。激光辐照治疗后24小时,在每一组中随机选取一只裸鼠处死后取肿瘤组织进行H＆E、TUNEL、Ki-67抗体染色,评价各组治疗后肿瘤细胞的形态、增殖及凋亡情况。治疗后每隔一天测量裸鼠的体重和肿瘤大小,观察24天后处死裸鼠,每组随机选取一只裸鼠取主要器官（心、肝、脾、肺、肾）进行H＆E染色组织学分析,进一步评估治疗的生物安全性。结果 单独与HCuSNPs或DSF孵育后,即使纳米粒或化疗药的剂量增加到200 μg·mL-1,培养时间延长到48小时,也未检测到对4T1细胞的明显细胞毒性。相反,DSF@PEG-HCuSNPs对4T1细胞表现出明显的细胞毒性,细胞存活率随DSF@PEG-HCuSNPs浓度的增加和培养时间的延长而下降,当与4T1细胞共孵育的DSF@PEG-HCuSNPs浓度为200 μg·mL-1,培养时间达到48小时,55.3%的4T1乳腺癌细胞被杀死。将4T1细胞与DSF@PEG-HCuSNPs共孵育,并给予1064nm激光辐照,随着DSF@PEG-HCuSNPs浓度、NIR-Ⅱ激光功率和辐照时间的增加,DSF@PEG-HCuSNPs结合NIR-Ⅱ激光辐照比单纯DSF@PEG-HCuSNPs和PEG-HCuSNPs结合NIR-Ⅱ激光辐照对4T1细胞的细胞毒性高得多,只有10.7%的细胞存活,表明了 DSF@PEG-HCuSNPs可以通过激光辐照和酸性肿瘤微环境原位激活化疗协同热疗诱导显著的细胞死亡。经雌性裸鼠和昆明鼠尾静脉注射DSF@PEG-HCuSNPs（20 mg·kg-1）后0、1、7、14和28天的主要器官H＆E染色图像均未见明显的组织病理学病变。此外,血常规分析和生化指标检测也显示DSF@PEG-HCuSNPs在整个观察期内对裸鼠和昆明鼠几乎无毒。血常规检查、血清生化分析及H＆E染色组织学分析均证明了 DSF@PEG-HCuSNPs具有良好的治疗生物安全性。通过红外热成像仪记录不同治疗组的肿瘤温度变化情况,可见HCuSNPs+1064 nm 激光组和 DSF@PEG-HCuSNPs+1064 nm 激光组在激光辐照10分钟的时间肿瘤温度分别达到了 51.9℃和51.7℃。与此形成鲜明对比的是,在相同的照射环境下,PBS注射后肿瘤温度仅升高5.5℃。通过体内治疗可见HCuSNPs组、DSF@PEG-HCuSNPs组、DSF组和单纯的1064 nm激光照射组的处理对肿瘤生长均无明显抑制作用。相比之下,HCuSNPs+激光组的肿瘤生长完全被抑制,但在第14天出现明显复发。而将DSF@PEG-HCuSNPs+1064nm激光照射组对肿瘤生长产生了显著的抑制作用,在24天的观察期内肿瘤被完全根除而未见复发。肿瘤组织的H＆E、TUNEL、Ki-67染色结果显示,在DSF@PEG-HCuSNPs+1064 nm 激光组和 HCuSNPs+1064 nm 激光照射组中,肿瘤组织出现了明显的凋亡/坏死,且DSF@PEG-HCuSNPs+1064 nm激光组的凋亡/坏死情况显著高于其他治疗组,证明了光热治疗与原位毒性Cu（DTC）2形成的结合可以有效抑制肿瘤的增殖。此外,在整个治疗期间,各治疗组的体重和重要器官的H＆E染色分析均未见明显变化,这也间接说明DSF@PEG-HCuSNPs具有良好的生物安全性。结论 制备的HCuSNPs将DSF有效地传递到肿瘤组织中,其中DSF@PEG-HCuSNPs可在肿瘤酸性微环境下降解,释放Cu2+和DSF药物分子,原位螯合转化为有毒的Cu（DTC）2复合物,从而增强了 DSF对肿瘤细胞的化疗作用,而1064 nm激光辐照不仅对肿瘤产生了光热治疗的效果,还增强了 HCuSNPs的降解,促进了 Cu2+和DSF的释放并转化为有毒的Cu（DTC）2复合物,达到了 NIR-Ⅱ光热治疗协同并增效肿瘤原位DSF化疗的效果。此外,体内生物相容性分析证明了 DSF@PEG-HCuSNPs的治疗生物安全性,使其具有广阔的临床肿瘤治疗应用前景。这项工作不仅代表了 TME激活的“无毒到有毒”转化纳米系统用于光热治疗增强的基于DSF化疗的独特范例,而且也为将FDA批准的药物重新利用于有效的癌症治疗提供了见解。