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糖(Carbohydrate)作为一种重要的有机化合物、三类重要生物大分子之一,几乎存在于所有生命体中。它不仅在生命活动中扮演着结构物质、能量供体和信息传递物质的重要角色,也被广泛应用于临床医学、药物开发、日用化学品中,与人类的健康和日常生活息息相关。硫酸软骨素(Chondroitinsulfate,CS)是一种分布广泛、极为重要的硫酸化糖胺聚糖,由[-4GlcAβ1-3GalNAcβ1-]二糖重复单元组成。CS可以根据硫酸化位点和修饰程度的不同被分为多种类型,不同种类的CS携带着多样的生物信息,参与不同的生命过程。不含有硫酸化修饰的软骨素(Chondroitin,CH)影响着Pasteurella multocida Type F、Escherichia coli K4、Caenorhabditis elegans 等的生命活动,不同分子量和N-乙酰化程度的CS-A在鼠脾细胞的T细胞中发挥不同功能,N-硫酸化修饰CS拥有显著优于CS的补体抑制活性,而岩藻糖修饰的CS(Fucosylated chondroitin sulfate,FucCS)具有良好的抗凝血和抗血栓形成等生物活性。针对组织提取法制备的CS存在微观结构不确定、分子量不均一等问题,科学家们发展了化学法、酶法、化学酶法和固相合成法等各具特色的CS合成方法,但均一 CS糖链的获取仍面临步骤繁琐、分离困难等挑战。为了高效制备CH糖链及其衍生物,促进从分子水平了解不同CH糖链功能差异和构效关系,本论文开展了均一 CH糖链及其衍生物的体外化学酶法合成方法的研究。论文第二章,我们发展了一种逐步酶法合成系列CH寡糖片段和一锅酶法同步化合成均一 CH糖链两步偶联的酶法合成策略。以GalNAcβ-N3为受体,逐步酶法制备得到系列 CH 寡糖 GlcAβ1-3GalNAcβ-N3(CH2β-N3,32 mg,86%)和GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAcβ-N3(CH3β-N3,27 mg,90%);以 GalNAcβ-N3和逐步酶法合成的CH寡糖片段为受体,利用一锅酶法的合成策略以58～84%产率制备得到9种10.8?22.5 mg的CH糖链,以CH3β-N3为受体合成的3种CH糖链PDI指数范围在1.05?1.29,可以认为是聚合度均一的CH多糖。进一步实验发现,以CH3β-N3为受体合成的CH糖链的分子量和受体/供体摩尔浓度比例具有良好的线性关系,由此,我们建立了酶法合成低、中、高分子量聚合度均一 CH糖链的策略。应用该酶法合成策略,实现了 5种聚合度均一 CH衍生物的制备。通过向一锅酶法合成体系中加入不同比例的糖核苷酸衍生物UDP-GalNTFA,获得了含有不同比例[-4GlcAβ1-3GalNTFAβ1-]二糖重复单元的均一 CH衍生物5(10 mg,31%)和6(7 mg,47%)。合成的糖链经碱性水解,高效制备了 2种含有不同两性离子重复单元[-4GlcAβ1-3GalNH2β1-]比例的CH衍生物7(6 mg,64%)和8(4mg,73%)。随后,利用化学修饰策略,制备获得均一的N-硫酸化CH多糖(4 mg,67%)。合成的聚合度均一 CH糖链及其衍生物为CH构效关系和分子水平作用机理的研究奠定了工作基础,发展的聚合度均一 CH糖链及其衍生物的两步偶联酶法合成策略将为深入的糖生物学研究提供更加丰富的糖链资源。论文第三章,我们开展了岩藻糖基化CH衍生物FucCS寡糖的体外酶法合成研究。以逐步酶法合成的CH寡糖为受体、GDP-Fuc为供体,建立多组平行实验,对课题组前期工作中已成功表达的Hpα1,3FucT和Hmα1,2FucT两种岩藻糖基转移酶的催化反应活性和底物选择性进行分析,首次发现Hpα1,3FucT可以识别含有GalNAcβ1-4GlcA序列的CH寡糖合成岩藻糖修饰的CH寡糖产物,甚至能够识别多个 GalNAcβ1-4GlcA 序列位点。以 GalNAcβ1-4GlcAβ1-3GalNAcβ-N3为受体,经Hpα1,3FucT催化,纯化得到岩藻糖修饰的CH寡糖GalNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcAβ1-3GalNAcβ-N3(6 mg,46%),首次确定 Hpα1,3FucT 能够对GalNAcβ1-4GlcA序列中GlcA残基的3-O位进行岩藻糖修饰。这是含有GalNAcβ1-4(Fucα1-3)GlcA序列CH寡糖的首次体外酶法合成,该酶的发现为FucCS寡糖的制备提供了一种新思路,体外酶法合成方法的建立也将提供更多结构种类的FucCS。