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研究的目的和意义:胰腺癌(Pancreatic cancer,PC)是一种发病率和死亡率均较高的消化系统恶性肿瘤,未经治疗的患者平均生存期为3个月,手术治疗后的患者平均生存期为10～20个月,5年生存率为5-7%。由于早期缺乏特异性症状和有效的生物标记物,胰腺癌患者早期诊断困难,不足20%的患者可在早期被诊断,并给予手术治疗,而大部分的患者确诊时已处于晚期或有转移,无法给予手术治疗。虽然现有的成像技术可以提供有关胰腺组织的形态学信息,但单模态成像对于胰腺癌诊断的敏感性和特异性均较低。胰腺癌对传统放化疗不敏感。因此,寻找胰腺癌早期的诊断手段和有效的治疗方法迫在眉睫。分子影像提供了将多模态成像和靶向治疗相结合的方法,为胰腺癌的早期诊断和有效治疗带来了希望。金纳米笼(gold nanocages,AuNCs)因其中空的内部结构、良好的生物相容性、表面易修饰等独特的理化特性而广泛用于肿瘤的诊疗一体化中。将多种特异性造影剂、治疗药物、靶向分子等与AuNCs进行特性耦合,不仅能延长造影剂的半衰期、改善成像模式单一、提高生物相容性,也能降低治疗药物的毒副反应,实现胰腺癌的诊疗一体化。本研究设计合成了一种以AuNCs为载体,以PH值/透明质酸酶为控制阀门,载冬凌草甲素(oridonin,ORI),靶向磷脂酰肌醇蛋白多糖-1(glypican-1,GPC1)的多模态诊疗一体化纳米探针GPC1-Gd-ORI@HAuNCs-Cy7(ORI-GPC1-NPs)。通过体内、外实验,验证其近红外荧光(near-infrared fluorescence,NIRF)和磁共振(magnetic resonance,MR)成像的能力,以及抗肿瘤效应。方法:先利用乙二醇还原法制备银纳米立方粒子,并在此基础上通过离子置换法,合成粒径为50 nm的AuNCs。室温下加入ORI并搅拌,使AuNCs内部负载ORI。通过Au-S键结合,得到透明质酸包裹的ORI@AuNCs(ORI@HAuNCs)溶液。通过酯化反应,使GPC1抗体、Gd、Cy7偶联到纳米微粒上,最终合成靶向多模态纳米探针ORI-GPC1-NPs。同时合成非靶向纳米探针Gd-ORI@HAuNCs-Cy7(ORI-NPs)作为对照。通过性能检测,评价了ORI-GPC1-NPs的形态结构、平均水动力尺寸、Zeta电势、所含元素、官能团、稳定性、药物的负载和释放、靶向性、体外多模态成像性能。通过MTT、流式细胞术、Western Blot,Transwell实验,从细胞水平分析ORI-GPC1-NPs对胰腺癌细胞株增殖、凋亡、周期分布、侵袭的影响。选取健康裸鼠,连续21 d通过尾静脉注射高、中、低剂量的ORI-GPC1-NPs,监测小鼠体重,通过血液常规生化检测,分析其对小鼠体内血液学系统、肝功能、肾功能的影响,并明确体内实验的给药剂量。构建原位胰腺癌裸鼠模型,通过尾静脉注射ORI-GPC1-NPs,在特定的时间点(注射前、注射后12 h、注射后24 h、注射后48 h)进行体内NIRF和MR成像,评价其体内多模态成像的能力。并在成像完成后,处死小鼠,收获肿瘤组织和主要脏器,通过离体NIRF成像,以及电感耦合等离子质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)检测,分析ORI-GPC1-NPs的体内生物学分布。将荷瘤小鼠随机分为阴性对照组、吉西他滨(gemcitabine,GEM)组、ORI、ORI-NPs、ORI-GPC1-NPs组,连续14 d,通过尾静脉注射不同药物,监测荷瘤小鼠的体重和肿瘤体积,并绘制时间-体重曲线图和时间-肿瘤体积曲线图。最后1d,处死小鼠,收获肿瘤组织和主要脏器,进行苏木精&伊红(hematoxylin&eosin,HE)染色和免疫组化(immunohistochemistry,IHC),从体内水平,进一步验证ORI-GPC1-NPs的抗肿瘤效应。结果:1.性能检测结果显示,成功合成目标纳米探针ORI-GPC1-NPs。ORI-GPC1-NPs近球形,具有优异的分散性,良好的稳定性,以及体外NIRF/MR多模态成像性能。ORI-GPC1-NPs中ORI的负载量较高,具有PH值/酶敏感的控制性释放。2.Real-time PCR和流式细胞分析结果显示,在胰腺癌细胞株PANC-1、BXPC-3、SW1990中GPC1高表达,人胚肾293T细胞中GPC1低表达。3.透射电镜在高放大倍数下显示内吞的ORI-GPC1-NPs样品存在于PANC-1和BXPC-3细胞内(GPC1高表达),而293 T细胞(GPC1低表达)内未见内吞的ORI-GPC1-NPs样品。4.体外细胞学实验结果显示ORI-GPC1-NPs可抑制胰腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,阻滞细胞周期,抑制细胞侵袭。5.体内毒性实验结果显示,和阴性对照组相比,高、中、低剂量ORI-GPC1-NPs组裸鼠体重,血液常规指标,肝、肾功能生物标记物指标,均未发现显著变化,P>0.05。6.体内成像结果显示,ORI-NP组肿瘤部位的NIRF/MR信号强度在注射12 h后达到峰值。随着时间的延长,强度逐渐减弱,注射48 h后几乎消失。而ORI-GPC1-NPs组肿瘤部位在注射12 h后也可检测到NIRF/MR信号。随着时间的延长,肿瘤部位的信号强度逐渐增强,在注射24 h后达到峰值,显著高于对照组,P<0.05。在注射48 h后,观察组肿瘤部位NIRF/MR信号强度仍稳定存在,显著高于对照组,P<0.05。7.离体NIRF和ICP-MS结果显示,ORI-GPC1-NPs主要积累在肝脏、肿瘤、肾脏内。注射12 h后,ORI-NPs和ORI-GPC1-NPs在组织内分布一致;在注射24 h和48 h后,ORI-GPC1-NP在肿瘤组织中的积累显著高于ORI-NPs。8.治疗期间,荷瘤小鼠体重均未出现显示变化;治疗后,ORI-GPC1-NPs组肿瘤体积和重量远低于其他对照组;HE结果显示,ORI-GPC1-NPs组肿瘤细胞可见不规则扩大的细胞间隙等损伤,而肝、肾细胞未见明显损伤;IHC结果显示,ORI-GPC1-NPs可降低肿瘤组织内Bcl-2的表达,升高Caspase-3的表达。结论:1.ORI-GPC1-NPs可与GPC1高表达的胰腺癌细胞进行特异性靶向结合,延长了ORI-GPC1-NPs的血液循环时间,减少对正常组织细胞的影响。2.GPC1-GEM-NPs具有生物相容性,在体内无明显不良反应。3.ORI-GPC1-NPs主要经肝、肾代谢。4.ORI-GPC1-NPs是理想的NIRF/MR多模态成像探针,且抗肿瘤效应显著,可用于胰腺癌的早期诊断和靶向治疗。