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对羟基苯甲酸酯类物质(Parabens,PBs)是目前世界上用途最广、用量最大、应用频率最高的防腐剂之一。食入、皮肤反复涂抹或吸入接触含有PBs的食品、日用品或其他产品为人群暴露的主要途径。过去曾认为PBs是低毒的防腐剂,但是近年来研究发现对其具有弱雌激素样活性。PBs的雌激素活性的强弱直接取决于烷基的大小。烷基分子量越大,则其雌激素活性越强。研究显示,对羟基苯甲酸丁酯(n-butylparaben, n-BP)暴露损伤雄性生殖系统,包括睾丸重量下降、睾酮下降、精子数减少等。由于对羟基苯甲酸酯的毒性特征和毒性作用机制研究并不多,因此有必要对其毒性作用特征和毒性作用机制做深入的研究,以补充该类物质的毒性数据资料,为制定卫生标准提供科学依据。本研究选择n-BP为目标研究物质,己烯雌酚(DES)为阳性对照物,青春期暴露为模型,选用断乳后雄性Wistar大鼠(PND21)为研究对象,染毒28天。将动物随机分为5组,玉米油对照组；n-BP染毒组(160、400mg/kg); DES染毒组(1、10μg/kg),探究n-BP青春期暴露对雄性大鼠生殖内分泌毒性作用特征、潜在毒性作用机制以及其与DES的异同,发现新的生物标志物。一、对羟基苯甲酸丁酯暴露对青春期雄性大鼠生殖系统毒性作用特征1、n-BP暴露对青春期雄性大鼠体重、脏器和生殖发育的影响该部分选用体重、脏器重量、脏器系数、肛门生殖器距离(anogenital distance, AGD)、包皮分离时间(preputial separation, PPS)为效应终点。研究结果显示,n-BP染毒组睾丸重量及睾丸系数、前列腺重量及前列腺系数降低,AGD减小,PPS发生延迟,睾丸出现病理改变。除体重无明显变化外,其他一般毒性作用与阳性物质DES基本一致。2、n-BP暴露对青春期雄性大鼠循环血及睾丸内激素的影响该部分通过放射免疫方法对睾酮(testosterone, T)、17β-雌二醇(17p-estradiol, E2)进行测定。研究结果显示,n-BP暴露后,雄性大鼠循环血及睾丸内T水平显著降低,E：水平显著升高。该结果与阳性物质DES染毒相一致。3、n-BP暴露对青春期雄性大鼠精子生成的影响该部分以附睾尾精子计数和睾丸每日精子生成量为效应指标。研究结果显示,n-BP暴露后,雄性大鼠附睾尾精子计数和睾丸每日精子生成量均显著降低,该结果与阳性物质DES相一致。二、对羟基苯甲酸丁酯暴露对青春期雄性大鼠生殖系统毒性作用机制1、n-BP暴露后青春期雄性大鼠激素合成与代谢障碍机制该部分通过荧光定量PCR、免疫印迹和免疫组织化学方法,对睾丸内非受体途径,即类固醇合成代谢途径进行研究。结果显示,n-BP暴露后细胞色素P450侧链裂解酶(cytochrome cholesterol side chain cleavage, P450scc)转录水平和蛋白水平均显著降低,3p-羟基甾体脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase/isomerase,3β-HSD)的转录水平未见明显改变。对雌二醇的合成代谢途径进行研究结果显示,芳香化酶(Aromatase, Arom)转录水平和蛋白水平均显著增加,磺基转移酶(estrogen sulfotransferase, SulT1E1)转录水平和蛋白水平均显著降低。该结果与阳性物质DES相一致。2、n-BP暴露后青春期雄性大鼠核受体诱导生精障碍机制该部分通过荧光定量PCR和免疫组织化学方法,对睾丸内核受体途径进行研究。结果显示,n-BP暴露后雌激素受体α(estrogen receptor, ERa)表达水平显著升高,而雄激素受体(androgen receptor, AR)无明显变化。该结果与阳性物质DES相一致。三、对羟基苯甲酸丁酯暴露后青春期雄性大鼠睾丸内microRNA调节精子发生1、n-BP暴露后青春期雄性大鼠睾丸内microRNA的变化特征该部分通过荧光定量PCR技术对n-BP暴露后可能参与精子发生调控的miRNA进行研究。结果显示,n-BP暴露miR-22显著降低,miR-152显著升高,miR-471显著升高,miR-34b无显著性变化。DES暴露后miR-152显著升高,miR-471显著降低,miR-22、miR-34b未见显著性变化。2、n-BP暴露后睾丸内miR-22, miR152参与精子发生的调节机制该部分通过荧光定量PCR技术和免疫印迹方法对重点研究的miRNA (miR-22,miR-152)的下游靶蛋白ERα和甲基化转移酶(DNA methltransferases, Dnmts)进行检测,并研究miRNA对靶蛋白的表达水平的影响。ERα的结果在第二部分第二节中已阐述。Dnmt研究结果显示,n-BP暴露后青春期雄性大鼠Dnmt3b转录水平显著降低,Dnmt1和Dnmt3b蛋白水平显著降低;而DES染毒后Dnmts转录水平均未见显著改变,Dnmt1和Dnmt3b蛋白水平显著降低。结论n-BP暴露后青春期雄性大鼠生殖系统发生损伤,主要表现为睾酮／雌二醇平衡紊乱、睾丸出现病理性改变、精子发生障碍。其机制包括类固醇合成代谢酶水平异常、雌激素受体水平异常。本研究通过体内实验首次提出了miRNA影响精子发生的潜在机制,即：n-BP暴露导致青春期雄性大鼠睾丸内miR-22下调,进而促进其下游靶蛋白ERa的表达,从而加强了雌激素效应,丰富了雌激素影响精子生成机制的理论。另一方面,n-BP暴露导致青春期雄性大鼠睾丸内miR-152上调,进而抑制其下游靶蛋白Dnmt的表达,发现了miRNA与甲基化转移酶共同参与雌激素活性物质对睾丸损伤可能的机制,丰富了表观遗传学调控在生殖系统损伤中作用的理论。