目的白血病是一种造血干细胞异常的克隆性疾病,它的治疗目前仍以化疗为主,但存在毒副作用大的弊端,近来生物治疗逐渐成为新的研究热点。Wnt信号通路与多种肿瘤的发生密切相关,通常认为经典的Wnt信号(Wnt/β-catenin)是一种促癌通路,而非经典Wnt通路是一种抑癌通路,我们前期研究表明Wnt5a作为Wnt家族的一员,它可优势结合Ror2受体,激活非经典通路,进而抑制慢性髓系白血病细胞株K562增殖,预实验中还发现K562细胞过表达Ror2时,出现了细胞凋亡,而过表达Wnt5a时却没有发生细胞凋亡的现象。本课题旨在进一步明确Ror2是否可诱导K562细胞凋亡并初步探讨其可能的机制。孤儿受体Ror2在胚胎发育的早期表达最高,对组织和器官的形成起着重要的作用。Ror家族在白血病中的报道近年来逐渐增加,但主要是Ror1,如Ror1在人类淋巴细胞白血病中高表达,是一种致癌因子,但Ror2的报道还非常少。我们曾检测了26例非恶性血液病和9例急/慢性白血病病例骨髓标本,发现在白血病病例中,Ror2表达降低,而非恶性血液病和白血病缓解病例中表达升高。本研究中发现:过表达Ror2的K562细胞出现了细胞凋亡,提示Ror2在白血病中可能是一种抑癌因子,Ror2诱导细胞凋亡是其抑制髓系白血病细胞增殖的作用之一,其机制可能与上调了促凋亡蛋白caspase3、bax,下调了抗凋亡蛋白survivin、bcl-2有关。研究方法中,为了制备过表达Ror2受体的K562细胞模型,采用了Polybrene促进重组腺病毒的转染,高效导入Ror2基因,为改善血液细胞难转染的难题提供了良好的方法,也为后续实验打下了良好的基础。方法1、Polybrene增强重组腺病毒感染K562细胞效应的研究1.1以不同用量的重组腺病毒Ror2(Ad Ror2)感染K562细胞,求得最佳的重组腺病毒用量。1.2以不同浓度的polybrene和最佳的Ad Ror2用量感染K562细胞,求得最佳的polybrene用量。1.3以最佳的polybrene浓度和最佳的Ad Ror2用量感染K562细胞1d、2d、3d、4d、5d,获得最佳的polybrene感染时间。1.4联用最佳的polybrene浓度和最佳的Ad Ror2用量感染K562细胞后,RT-PCR和Western blot检测Ror2 m RNA和蛋白的表达水平。2.Ror2抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡的研究2.1 CCK8法检测Ad Ror2感染K562细胞后细胞增殖的变化。2.2用流式细胞仪分别检测Ad Ror2感染K562 30h、48h后,细胞周期和细胞凋亡的变化。3、Ror2诱导K562细胞凋亡机制的初步研究3.1 Western blot检测Ad Ror2感染K562细胞后,促凋亡蛋白caspase3和bax的表达。3.2 Western blot检测Ad Ror2感染K562细胞后,抗凋亡蛋白survivn和bcl-2的表达。结果1、Ad Ror2感染K562细胞的最佳用量是8μl/105个细胞;polybrene增强Ad Ror2感染效率的最佳浓度为3μg/ml,最佳作用时间是2d。2、联用最佳polybrene浓度和最佳Ad Ror2用量感染K562细胞2d后,与对照组相比,Ror2在m RNA和蛋白表达水平均高于对照组。3、Ad Ror2感染K562细胞1d、2d、3d、4d、5d后,与对照组相比细胞增殖降低。4、Ad Ror2感染K562细胞30h、48h后,细胞周期阻止于G2/M期,与对照组细胞(34.96±0.16)%相比,其G2/M期的细胞明显增高(59.88±0.25)%。细胞凋亡百分比(13.52±0.48)%高于对照组(10.71±0.50)%。5、Ad Ror2感染K562细胞2d后,促凋亡蛋白caspase3和bax的表达均明显高于对照组;而抗凋亡蛋白survivin和bcl-2的蛋白表达量均低于对照组。结论在慢性髓细胞白血病细胞株K562中,polybrene促进了重组腺病毒Ror2感染K562细胞的效率,解决了K562细胞难导入基因的难题。过表达Ror2可明显抑制K562细胞的增殖,阻止细胞于G2/M期并诱导细胞凋亡,其机制可能与Ror2参与了上调促凋亡蛋白caspase3和bcl2的表达,下调抗凋亡蛋白survivin和bax表达有关。